深藍(lán)云qPCR知識(shí)小課堂-SYBR Green染料法

TaqMan探針法因其良好的特異性以及可多重檢測(cè)而受到實(shí)驗(yàn)人員的青睞，其實(shí)除了探針法外，還有很多好的實(shí)驗(yàn)方法也被實(shí)驗(yàn)人員廣泛認(rèn)可，這次就介紹一下另一個(gè)應(yīng)用廣泛的方法：SYBR Green染料法，它又是因?yàn)槟男﹥?yōu)點(diǎn)獲得實(shí)驗(yàn)人員的青睞呢？

染料法原理

染料法一般使用的是SYBR Green I染料，這是一種可以與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料，其不會(huì)與單鏈DNA結(jié)合，且在游離狀態(tài)下幾乎無熒光，只有與雙鏈DNA結(jié)合才會(huì)發(fā)出熒光，因此將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈DNA數(shù)量與熒光強(qiáng)度直接關(guān)聯(lián)，產(chǎn)生實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的效果。

SYBR Green染料法優(yōu)點(diǎn)

☑  通用性好，適合進(jìn)行大多數(shù)類型的定量反應(yīng)，可以進(jìn)行熔解曲線的分析。

☑  無需設(shè)計(jì)探針，引物設(shè)計(jì)相對(duì)簡單，不用考慮基團(tuán)選擇，易于上手；成本低，無需合成探針。

☑  無需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本。

SYBR Green染料法缺點(diǎn)

SYBR Green染料法也有其缺點(diǎn)，SYBR Green染料法一個(gè)反應(yīng)只能檢測(cè)一個(gè)基因，無法進(jìn)行二重甚至多重的實(shí)驗(yàn)。同樣的相對(duì)于TaqMan探針法其特異性較差，當(dāng)引物存在二聚體或者非特異性擴(kuò)增時(shí)，染料同樣可以結(jié)合并發(fā)出熒光，影響定量結(jié)果。因此對(duì)于SYBR Green染料法而言，設(shè)計(jì)一套好用的引物是重中之重。

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設(shè)計(jì)好引物后，我們?cè)撛趺催M(jìn)行實(shí)驗(yàn)?zāi)兀?/span>

1.實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

我們需要對(duì)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增效果進(jìn)行分析，使用陽性模板進(jìn)行擴(kuò)增，確定擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶，且大小符合設(shè)計(jì)預(yù)期，如有條件可以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，保證準(zhǔn)確性。當(dāng)引物無問題后，進(jìn)行反應(yīng)條件的探索，對(duì)退火溫度進(jìn)行溫度梯度檢測(cè)，找到合適的退火溫度，即PCR擴(kuò)增效果最好，陰性模板無擴(kuò)增，條帶單一，熔解曲線單峰等。

2.預(yù)實(shí)驗(yàn)

設(shè)計(jì)好引物并探索好實(shí)驗(yàn)條件后，對(duì)樣本進(jìn)行一次預(yù)實(shí)驗(yàn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)將樣本進(jìn)行梯度稀釋用以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析內(nèi)參基因以及目的基因的擴(kuò)增效率是否接近且在100%左右，其次可確認(rèn)高濃度模板中是否有抑制劑干擾，從而確定實(shí)驗(yàn)時(shí)合適的模板濃度（樣本是否需要稀釋或濃縮）。

3.正式實(shí)驗(yàn)

當(dāng)我們完成了實(shí)驗(yàn)條件和預(yù)實(shí)驗(yàn)后就可以進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)了，每個(gè)樣品都需要3個(gè)或以上的重復(fù)，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

 

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