外泌體NfL，輕度創(chuàng)傷性腦損傷后遠(yuǎn)隔癥狀的診斷性生物標(biāo)記物？

導(dǎo)讀
持續(xù)輕度創(chuàng)傷性腦損傷（mTBI）是一種復(fù)雜的、異質(zhì)性的損傷，其病理機(jī)制包括神經(jīng)軸索損傷和血管損傷，并伴有強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。機(jī)械組織損傷后，受損細(xì)胞釋放外泌體到胞外空間。外泌體可以穿過血腦屏障，并可以從外周循環(huán)系統(tǒng)中分離出來，因此可以很容易地從外周循環(huán)中檢測(cè)其含量。外泌體所攜帶的物質(zhì)可以使研究人員更加簡單方便地對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織特異性的病理過程做出解析。

本研究通過對(duì)具有mTBI病史的退伍軍人進(jìn)行研究，驗(yàn)證了外周循環(huán)系統(tǒng)（外泌體和血漿）中候選TBI生物標(biāo)記物（NfL、IL-6、IL-10、TNF-α和VEGF）與持續(xù)性神經(jīng)行為癥狀之間的關(guān)系。

研究中使用Simoa HD-1分析儀，檢測(cè)NfL、IL-6、TNF-α、IL-10和VEGF在外泌體和血漿中的濃度水平并進(jìn)行分析。Simoa HD-1分析儀是一款全自動(dòng)數(shù)字式單分子免疫陣列檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，是基于其聲名顯赫的單分子免疫陣列技術(shù)（Simoa）開發(fā)的超靈敏的蛋白質(zhì)檢測(cè)平臺(tái)，其檢測(cè)的平均靈敏度是傳統(tǒng)技術(shù)的1000倍。

發(fā)表期刊： Neurology；IF=8.689
原文鏈接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32461282/

研究背景
mTBI與損傷后數(shù)年內(nèi)持續(xù)存在的或惡化的神經(jīng)行為功能障礙有關(guān)。常見的創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）臨床后遺癥和合并癥，例如腦震蕩后遺癥（PCS），創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（PTSD）以及抑郁癥都有著明顯的癥狀重疊，并且在持續(xù)重復(fù)性TBI的患者中可能更嚴(yán)重。

本研究檢測(cè)了具有mTBI病史的退伍軍人的外周血和血漿中候選生物標(biāo)記物的水平，并探討其與慢性癥狀的關(guān)系。采用Simoa技術(shù)檢測(cè)了神經(jīng)絲輕鏈蛋白NfL、腫瘤壞死因子TNF-α、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在外泌體和血漿中的濃度水平。比較了上述候選生物標(biāo)記物與PCS、PTSD和抑郁癥狀之間的關(guān)系；以及無創(chuàng)傷性腦損傷（對(duì)照組）、1-2次mTBI患者和重復(fù)性（3次或更多）mTBI患者的生物標(biāo)記物水平。

樣本
參與者被分為不同的TBI組進(jìn)行分析，具體如下：（1）重復(fù)性（3次或更多）mTBI，（2）1-2 次TBI患者，和（3）對(duì)照組（無TBI史）。研究還比較了有或無爆炸暴露的受試者，以及伴有意識(shí)喪失/創(chuàng)傷性遺忘（LOC/PTA）的mTBI患者與只有意識(shí)改變（AOC）沒有LOC/PTA的mTBI患者之間的比較。

研究方法
01、PCS、PTSD和抑郁癥癥狀的評(píng)估
采用神經(jīng)行為癥狀量表（NSI）評(píng)定PCS癥狀嚴(yán)重程度；使用創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙檢查表軍用版（PCL-M）評(píng)估PTSD的癥狀；抑郁癥狀采用9項(xiàng)患者健康問卷抑郁量表（PHQ-9）評(píng)估。

02、血樣收集和蛋白質(zhì)檢測(cè)
生物標(biāo)記物分析是在通過國際紅十字會(huì)（IRB）批準(zhǔn)的方案下進(jìn)行的。檢測(cè)血漿和從血漿中分離出的外泌體中的生物標(biāo)志物水平。

03、從血漿中分離出外泌體
用ExoQuick法從含EDTA的冰凍血漿中分離出外泌體。

04、蛋白質(zhì)定量
使用Simoa HD-1分析儀，檢測(cè)NfL、IL-6、TNF-α、IL-10和VEGF在外泌體和血漿中的濃度水平并進(jìn)行分析。所有待檢物的濃度變異系數(shù)CV值（板內(nèi)和板間）值均小于20%。

05、數(shù)據(jù)處理
本研究建立了包括人口統(tǒng)計(jì)學(xué)（年齡和性別）和臨床TBI特征（TBI的數(shù)量、最后一次TBI距今年限、第一次TBI距今年限、由爆炸引起的TBI歷史或相關(guān)的PTA或LOC癥狀）的廣義線性模型（GLMs），以評(píng)估PCS、PTSD和抑郁癥癥狀與生物標(biāo)記物濃度水平之間的關(guān)系。

結(jié)論
01人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征
195名受試者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征如表1所示。與對(duì)照組相比，有TBI病史的個(gè)體表現(xiàn)出更嚴(yán)重的PCS、PTSD和抑郁癥狀。重復(fù)性TBI患者較僅有1或2次TBI的患者的PCS癥狀更為嚴(yán)重。重復(fù)性mTBI組患者中由爆炸引起的TBI的次數(shù)也顯著高于1-2次mTBI的患者組。重復(fù)性mTBI組中，首次TBI后距今的年限較長；在1-2次mTBI組中，最近一次TBI距今年限較短。

表1：人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征

02、重復(fù)性mTBI與生物標(biāo)志物水平升高具有相關(guān)性
該研究比較了對(duì)照組、1-2次mTBI組和重復(fù)性mTBI組的生物標(biāo)記物水平。觀察到外泌體NfL和血漿NfL存在顯著的組間差異。與對(duì)照組相比，1-2 次mTBI組和重復(fù)性mTBI組的外泌體和血漿NfL水平均升高。（表2）

03、TBI特征與生物標(biāo)志物水平
TBI特征與生物標(biāo)志物水平之間的相關(guān)性分析結(jié)果如圖2所示。mTBI次數(shù)與較高的外泌體和血漿NfL以及血漿IL-6濃度呈正相關(guān)。此外，首次TBI后的年數(shù)與較高的外泌體和血漿NfL、血漿TNF-α、血漿VEGF濃度呈正相關(guān)。同樣，自上次TBI以來的年數(shù)與外泌體NfL水平呈正相關(guān)。然而，IL-6水平隨著時(shí)間的推移而下降，自上次TBI以來的年數(shù)與IL-6水平呈負(fù)相關(guān)。自上一次TBI以來，血漿NfL和血漿VEGF之間的相關(guān)性略為顯著。 

圖2. TBI特征與生物標(biāo)志物水平的相關(guān)性

04、生物標(biāo)記物水平與PCS、PTSD和抑郁癥狀的嚴(yán)重程度有關(guān)
TBI癥狀與生物標(biāo)志物水平之間的相關(guān)性結(jié)果如圖3所示。NSI總分與外泌體NfL呈中度相關(guān)，與血漿NfL和血漿TNF-α輕度相關(guān)。研究還評(píng)估了每個(gè)NSI分量表（即軀體、情感、認(rèn)知和前庭）與生物標(biāo)記物水平之間的可能相關(guān)性。總的來說，外泌體NfL也與大多數(shù)NSI分量表呈中度相關(guān)。同樣，血漿NfL水平與NSI軀體、認(rèn)知、前庭和有效子量表中的較高分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。軀體和認(rèn)知子量表的高分與血漿TNF-α濃度降低呈弱相關(guān)。 

此外，PCL-M評(píng)分與外泌體NfL水平呈中度相關(guān)，與血漿NfL和TNF-α水平呈弱相關(guān)性。PCL-M評(píng)分與外泌體IL-6濃度之間呈微弱相關(guān)性。PHQ-9評(píng)分與外泌體NfL和血漿NfL濃度水平相關(guān)。

為了評(píng)估生物標(biāo)記物水平與NSI、PCL-M和PHQ-9評(píng)分之間的相關(guān)性，利用校正后的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征GLM模型（表3）進(jìn)行分析。觀察到較高的NSI、PCL-M和PHQ-9評(píng)分與外泌體和血漿NfL水平的增加之間的關(guān)聯(lián)。

圖3. TBI癥狀與生物標(biāo)志物水平的相關(guān)性

表3. 行為癥狀的廣義線性模型

小結(jié) 
該研究結(jié)果表明，有mTBI病史的退伍軍人，尤其是重復(fù)性TBI，其候選生物標(biāo)志物（NfL、IL-6、IL-10、TNF-α和VEGF）的活性發(fā)生改變，這與慢性神經(jīng)和行為癥狀相關(guān)。具體來說，在有重復(fù)mTBI病史的患者中，NfL的外泌體和血漿水平較高；NfL是軸突損傷的神經(jīng)標(biāo)志物，反映了反復(fù)mTBI后的慢性、持續(xù)性軸突變性或遠(yuǎn)端調(diào)節(jié)失調(diào)。外泌體和血漿中NfL水平的升高與PCS、PTSD和抑郁癥狀的嚴(yán)重程度相關(guān)；NfL水平的升高與首次損傷后的年數(shù)之間的相關(guān)性表明：軸突的持續(xù)和進(jìn)行性調(diào)節(jié)失調(diào)可能是重復(fù)mTBI后慢性持續(xù)性癥狀綜合征的關(guān)鍵。

研究還發(fā)現(xiàn)炎癥標(biāo)志物TNF-α和PCS和PTSD癥狀之間的相關(guān)性。本研究已經(jīng)證明PTSD與外周血炎癥細(xì)胞因子的升高有關(guān)，還表明慢性，特別是重復(fù)性mTBI與PTSD之間存在聯(lián)系。這些發(fā)現(xiàn)有助于建立慢性mTBI持續(xù)性神經(jīng)行為癥狀的預(yù)后生物標(biāo)志物，并闡明mTBI后常見癥狀復(fù)合物的潛在機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)升高的神經(jīng)和神經(jīng)炎癥標(biāo)志物，包括mTBI總量和不斷增加的癥狀負(fù)擔(dān)之間的劑量依賴關(guān)系，可能為反復(fù)mTBI后持續(xù)癥狀發(fā)展的潛在發(fā)病機(jī)制提供了線索。

該項(xiàng)研究證明了這些容易獲得的生物標(biāo)記作物具有作為mTBI退伍軍人行為改變的預(yù)測(cè)因子的潛力，并為潛在的病理機(jī)制提供了見解。

外泌體檢測(cè)怎么可以沒有Simoa？
近年外泌體研究熱情持續(xù)高漲，外泌體最吸引人的是它能穿梭于細(xì)胞間，作為細(xì)胞間交互的橋梁�？v觀國家自然科學(xué)基金外泌體資助細(xì)分領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)近年來資助較多的是外泌體中核酸水平的研究，如miRNA，lncRNA和circRNA等，這可能與核酸研究的技術(shù)比較成熟有關(guān)。然而，蛋白作為最終表達(dá)產(chǎn)物，外泌體蛋白研究領(lǐng)域也必將成為外泌體研究不可或缺的部分。以前，由于體液、細(xì)胞上清中含有外泌體的量很低，利用傳統(tǒng)的Western Blot、ELISA等方法滿足不了低豐度蛋白的檢測(cè)�，F(xiàn)在，創(chuàng)新性的Simoa平臺(tái)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了檢測(cè)技術(shù)的不足，將極大推動(dòng)外泌體中蛋白成分的研究。

針對(duì)外泌體研究，SBC開發(fā)了一套完整的外泌體研究技術(shù)服務(wù)體系，提供從外泌體收集、鑒定到外泌體中核酸/蛋白提取、高通量篩選、生物信息數(shù)據(jù)分析、目的核酸/蛋白驗(yàn)證等技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目。