血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)活性熒光檢測方法介紹

 1.樣品的準(zhǔn)備。
a.血液樣品的準(zhǔn)備。
對于血清樣品，將全血在常溫如25℃下放置30分鐘至2小時(shí)，不要?jiǎng)×覔u晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1000-2000×g離心10分鐘，取黃色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黃色沉淀；對于血漿樣品，將全血用肝素或者EDTA進(jìn)行抗凝，4℃約1000-2000×g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿，注意不要吸取沉淀。血清和血漿都需置于冰上，如果不能立即檢測，也可以分裝并短期保存于-20℃或-80℃。對于凍存的樣品，在檢測前解凍后冰浴存放備用，使用前必須混勻。
b.細(xì)胞或組織樣品的準(zhǔn)備。
對于培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞，PBS 洗滌一次并吸凈殘留液體。對于培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞，先適當(dāng)離心(如100-500×g, 5分鐘)收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，棄上清并吸凈殘留液體。按照每100萬細(xì)胞加入100-200μl Lysis Buffer的比例加入Lysis Buffer，適當(dāng)吹打，冰浴5-10分鐘以充分裂解細(xì)胞。4℃約12,000×g離心3-5分鐘，取上清用于后續(xù)檢測。對于組織樣品，按照每10mg組織加入100μl Lysis Buffer的比例進(jìn)行勻漿。4℃約12,000×g離心3-5分鐘，取上清用于后續(xù)檢測。以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制備好的細(xì)胞或組織樣品如果不能立即檢測，可以-20℃或-80℃凍存。

2.試劑盒的準(zhǔn)備。
將Assay Buffer、Substrate和MCA Standard等試劑平衡至室溫后分別混勻備用。Positive Control (10X)存放于冰浴備用，使用完畢后宜立即按照試劑盒要求的條件保存。

3.陽性對照的準(zhǔn)備。
取適量的Positive Control (10X)并加入Assay Buffer對Positive Control (10X)進(jìn)行10倍稀釋。例如，取5μl Positive Control (10X)，加入45μl Assay Buffer，混勻，即得50μl Positive Control (1X)。96孔板檢測時(shí)，通常每孔10μl Positive Control (1X)即可。

4.MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)置。
取2μl MCA Standard (10mM)，加入198μl Assay Buffer，混勻，即為200μl 100μM的MCA溶液，分別取0、2.5、5、10、20、30、40、50μl的100μM MCA溶液加入96孔板中，并用Assay Buffer補(bǔ)足至100μl，此時(shí)，MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線的各孔MCA濃度和物質(zhì)的量分別為0、2.5、5、10、20、30、40、50μM或0、0.25、0.5、1、2、3、4、5nmol。也可自行設(shè)置適宜的MCA濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)定。

5.檢測體系的設(shè)置：
參照下表依次加入試劑盒各組分及樣品。初次檢測時(shí)，待測樣品可以稀釋一系列濃度梯度，以確保最終檢測值在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。待測樣品的稀釋倍數(shù)記為dil。

注：為獲得更加可靠的檢測結(jié)果，推薦每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

6.檢測。
a.振蕩混勻1-2分鐘，確�；旌铣浞�。
b.除MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線外每孔加入2μl Substrate，混勻。注：加入Substrate后反應(yīng)會(huì)立即開始，如果孔數(shù)較多的情況下，建議在低溫或使用排槍操作以減小各孔間加入Substrate的時(shí)間差而導(dǎo)致的誤差，混勻操作可在培養(yǎng)板振蕩器上進(jìn)行。
c.混勻后立即使用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光測定。設(shè)置熒光酶標(biāo)儀溫度為37℃，激發(fā)波長為325nm、發(fā)射波長為393nm，每5分鐘或10分鐘讀取一次數(shù)值。
注1：連續(xù)測定的時(shí)間可以根據(jù)待測樣品中ACE2的酶活性進(jìn)行調(diào)整，但是需確保獲得6個(gè)點(diǎn)以上的數(shù)據(jù)。對于ACE2的酶活較高的樣品，建議測定總時(shí)間為20分鐘或30分鐘，對應(yīng)的測定間隔時(shí)間設(shè)為2分鐘或5分鐘；對于ACE2的酶活很低的樣品，可以延長測定總時(shí)間為1至2小時(shí)，對應(yīng)的測定間隔時(shí)間設(shè)為10或20分鐘。
注2：如果熒光酶標(biāo)儀沒有溫控功能，也可以在室溫測定，但這樣檢測出來的是室溫條件下的酶活性，此時(shí)酶活性可能會(huì)偏低一些，不同的實(shí)驗(yàn)條件偏低的程度會(huì)有所不同。

7.計(jì)算。
a.計(jì)算每個(gè)樣品孔和空白對照孔的平均熒光值，可分別記錄為RFU空白對照、RFU陽性對照和RFU待測樣品。RFU，Relative Fluorescence Unit。選取待測樣品組MCA熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系的時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)用于分析，記錄呈線性關(guān)系的時(shí)間間隔為T，時(shí)間間隔T內(nèi)的熒光強(qiáng)度變化量為ΔRFU，即ΔRFU= RFU待測樣品(Time b) - RFU待測樣品(Time a)。
b.也可以直接比較各個(gè)樣品在一定時(shí)間內(nèi)的ΔRFU而確定樣品的ACE2相對活性，但須確保最終時(shí)間點(diǎn)時(shí)RFU讀數(shù)未達(dá)平臺(tái)。
c.也可將標(biāo)準(zhǔn)曲線各孔的熒光值減去標(biāo)準(zhǔn)品零濃度孔的熒光值，建立MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線。將ΔRFU代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可算出在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)樣品中MCA的生成量(記錄為A)。MCA的標(biāo)準(zhǔn)曲線請參考圖2A，MCA在0.02-5nmol (即0.2-50μM)范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。ACE2蛋白酶活性的計(jì)算公式如下：
ACE2 Activity (nmol/min/mg或U/mg) = A× dil/ (V_sample × T × C)
注：V_sample為檢測時(shí)待測樣品的體積(V_sample=10μl =0.01ml)；
A為步驟7c根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的MCA的生成量(nmol)；
dil為步驟5中樣品稀釋倍數(shù)；
C為樣品蛋白濃度(mg/ml，檢測步驟參考碧云天的BCA蛋白濃度測定試劑盒或去垢劑兼容型的Bradford蛋白濃度測定試劑盒)；
T為步驟7a中反應(yīng)時(shí)間(min)。
酶活力單位的定義為：溫度37℃條件下，每分鐘催化生成1nmol MCA酶量定義為一個(gè)單位(Unit, U)。
d.雖然本試劑盒中的ACE2底物已經(jīng)比較特異，但仍然有可能有一些蛋白酶可以切割本底物，建議進(jìn)一步使用ACE2特異性抑制劑MLN-4760 進(jìn)行驗(yàn)證。

圖2. 碧云天血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)活性熒光檢測試劑盒的MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線和對ACE2陽性對照及組織樣品的檢測效果圖。A. 本試劑盒的MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。B. 不同量的ACE2 Positive Control (1X)酶切底物，生成產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度示意圖。C. 小鼠不同組織的ACE2酶活性檢測效果及MLN-4760的抑制效果�？偟鞍琢慷紴�10μg，抑制劑為MLN-4760 ，終濃度為500nM)。D. ACE2 Positive Control (1X，10μl)及抑制劑MLN-4760 (終濃度為500nM)在293T細(xì)胞裂解液中的檢測效果(總蛋白量為22μg)。實(shí)際檢測數(shù)據(jù)會(huì)因?qū)嶒?yàn)條件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。