PCR擴(kuò)增效率的評(píng)估-擴(kuò)增曲線的解讀

做過(guò)PCR的小伙伴都知道，PCR前期的驗(yàn)證引物探針性能和確定最適反應(yīng)條件是確保正式實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的前提。PCR實(shí)驗(yàn)中有個(gè)相當(dāng)重要的工作——即是PCR擴(kuò)增效率的評(píng)估。擴(kuò)增效率是PCR檢測(cè)性能最重要的指標(biāo)之一，也是定量分析計(jì)算結(jié)果時(shí)所需要的參數(shù)。接下來(lái)，讓小編給大家細(xì)細(xì)說(shuō)來(lái)吧。
 

什么是擴(kuò)增效率
 

PCR是一種DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，通常包括了30 - 50個(gè)循環(huán)周期。每個(gè)循環(huán)中，目標(biāo)DNA分子的拷貝數(shù)最多會(huì)增加1倍。但在實(shí)際反應(yīng)中，1個(gè)DNA分子在1個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后被成功復(fù)制的概率，也就是擴(kuò)增效率E<1。而PCR的特點(diǎn)是反應(yīng)初期目標(biāo)DNA分子呈現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)，這個(gè)階段的擴(kuò)增效率可以無(wú)限接近于1；隨后由于反應(yīng)組分消耗或聚合酶活性下降或兩者共同作用，導(dǎo)致反應(yīng)效率逐漸下降并最終停止。不管是定量DNA分子初始量，還是計(jì)算表達(dá)量差異，都需要精確評(píng)估PCR擴(kuò)增效率。

如何評(píng)估擴(kuò)增效率

標(biāo)準(zhǔn)曲線是評(píng)估PCR擴(kuò)增效率最可靠和穩(wěn)定的一種方法，被研究者們廣泛認(rèn)可。該方法涉及到制作一系列的樣品來(lái)控制目標(biāo)模板的相對(duì)數(shù)量。這些樣品通常由濃縮的原液連續(xù)稀釋而成，最常用的是10倍稀釋。使用一系列稀釋樣品，采用標(biāo)準(zhǔn)qPCR程序進(jìn)行擴(kuò)增獲得Cq值，最后根據(jù)各樣品濃度及相應(yīng)的Cq值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程Cq= -klgX0+b，擴(kuò)增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR進(jìn)行定量分析時(shí)，要求擴(kuò)增效率范圍在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。

影響擴(kuò)增效率的關(guān)鍵因素

PCR的效率取決于許多因素，包括以下方面：

1）檢測(cè)的性能。這取決于引物、模板的序列和結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)和分子間的相互作用都會(huì)降低PCR效率。

2）樣品基質(zhì)。其中可能含有來(lái)自樣品的抑制劑和其他干擾物質(zhì)，或攜帶來(lái)自上游加工步驟的試劑。檢測(cè)樣品是否有抑制作用，可使用RNA或DNA Spikes方法進(jìn)行檢測(cè)，或者通過(guò)倍比稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)曲線也可以觀察到。

3）所用試劑及其濃度。本質(zhì)上，任何PCR試劑都會(huì)一定程度上限制PCR反應(yīng)速率和性能。

4）競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)。多重反應(yīng)時(shí)，各基因的擴(kuò)增存在反應(yīng)成分的競(jìng)爭(zhēng)。

5）qPCR儀器。由于儀器特定的硬件/軟件屬性和設(shè)置、以及用于提取Cq值的特定算法不同，相同的實(shí)驗(yàn)中，不同的儀器會(huì)產(chǎn)生不同的PCR效率。

6）技術(shù)重復(fù)。一般進(jìn)行3次以上的技術(shù)重復(fù)以校正實(shí)驗(yàn)誤差，重復(fù)數(shù)越多精確度越高。

7）連續(xù)稀釋中的移液體積。移液體積越大，移液器誤差或操作誤差引起的影響越小。

qPCR擴(kuò)增效率的判斷

qPCR擴(kuò)增效率主要是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系方程Cq=-klgX0+b來(lái)判斷，擴(kuò)增效率E在90%-110%之間時(shí)，認(rèn)為擴(kuò)增接近理想情況；參數(shù)R2要求≥0.98，R2越接近1，則說(shuō)明Cq和X0的Log值之間的相關(guān)性越高。

那么擴(kuò)增效率E表現(xiàn)不好，主要分為兩種情況：

1）過(guò)低的擴(kuò)增效率（<90％）

可能存在的原因：

☑ 移液器校準(zhǔn)不良或移液技術(shù)差。

☑ 不正確的稀釋導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)錯(cuò)誤。

☑ 染料濃度低熒光或者儀器未校準(zhǔn)染料。

☑ 引物設(shè)計(jì)不好或擴(kuò)增子具有二級(jí)結(jié)構(gòu)。

☑ 標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)態(tài)范圍太小。

☑ Taq酶無(wú)活性或活性降低。

☑ 樣品抑制。

2）過(guò)高的擴(kuò)增效率（> 110％）

可能存在的原因：

☑ 移液器校準(zhǔn)不良或移液技術(shù)差。

☑ 不正確的稀釋導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)錯(cuò)誤。

☑ 引物二聚體或非特異性擴(kuò)增。

☑ 標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)態(tài)范圍太小。

☑ 基因組DNA污染（僅限RNA模板未進(jìn)行DNase I處理或DNase I消化不完全）。

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