血液樣本的收集與保存方法

全血根據(jù)收集的條件，分成不抗凝和抗凝兩種。同時(shí)，不抗凝分離出的上層黃色的液體我們稱之為血清；抗凝分離出的上層黃色的液體我們稱之為血漿。

標(biāo)本的存放溫度及時(shí)間，血清、血漿及細(xì)胞分離的方法步驟也是分析前影響檢驗(yàn)結(jié)果的重要因素。抽血后，血細(xì)胞因代謝需要，要消耗掉部分營養(yǎng)成分，故對(duì)這些成分進(jìn)行測(cè)定時(shí)，需及時(shí)地離心以分離掉細(xì)胞成分。

采血前個(gè)體的準(zhǔn)備情況，如空腹時(shí)間的長短、采樣時(shí)間的確定及采血時(shí)患者的姿勢(shì)；止血帶應(yīng)用時(shí)間，輸液情況，體育運(yùn)動(dòng)，抗凝劑及穩(wěn)定劑的選用；標(biāo)本的處理等均可影響到某些檢驗(yàn)指標(biāo)的水平。故標(biāo)本采集過程應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化，以最大限度地減少分析前誤差。

一、不抗凝收集血清：

1、無添加劑的干燥空管收集:

血管內(nèi)壁均勻涂有防止掛壁的藥劑(硅油)。它利用血液自然凝固的原理使血液凝固，等血清自然析出后，離心使用。主要用于血清生化(肝功、腎功、心肌酶、淀粉酶等)、電解質(zhì)(血清鉀、鈉、氯、鈣、磷等)、甲狀腺功能、藥物檢測(cè)、艾滋病檢測(cè)、腫瘤標(biāo)志物、血清免疫學(xué)檢測(cè)。
    亦可直接用干燥EP管收集全血，充分靜置使得紅細(xì)胞充分自然凝固后，離心分離出血清待用或保存。

2、用促凝管收集:

采血管內(nèi)壁均勻涂有防止掛壁的硅油，同時(shí)添加了促凝劑。促凝劑能激活纖維蛋白酶，使可溶性纖維蛋白變成不可溶性的纖維蛋白聚體，進(jìn)而形成穩(wěn)定的纖維蛋白凝塊，如果想快點(diǎn)出結(jié)果時(shí)，可采用促凝管。一般靜置半小時(shí)到1小時(shí)，直接離心分離出血清待用或保存,常用于急診生化。

3、含有分離膠及促凝劑的采血管收集：

管壁經(jīng)過硅化處理，并涂有促凝劑可加速血液的凝固，縮短檢驗(yàn)時(shí)間。管內(nèi)加有分離膠，分離膠與PET管具有很好的親和性，確實(shí)起到隔離作用，一般即使在普通離心機(jī)上，分離膠能將血液中的液體成分(血清)和固體成分(血細(xì)胞)徹底分開并積聚在試管中形成屏障。離心后血清中不產(chǎn)生油滴，主要用于血清生化(肝功、腎功、心肌酶、淀粉酶等)、電解質(zhì)(血清鉀、鈉、氯、鈣、磷等)、甲狀腺功能、藥物檢測(cè)、艾滋病檢測(cè)、腫瘤標(biāo)志物、血清免疫學(xué)。

    用促凝管的優(yōu)點(diǎn)：

①、加速紅細(xì)胞的凝固，無需長時(shí)間的靜置；

②、帶有分離膠，有效的將血清分離出來，更好的避免溶血；

    收集血清的缺點(diǎn)：

①、需要紅細(xì)胞的充分凝固，所需靜置時(shí)間較長；

②、分離出的血清相對(duì)較少，1ml全血不抗凝約只能分離出0.2-0.3ml血清。

二、抗凝收集血漿：

收集抗凝全血，輕輕顛倒充分抗凝后，可直接離心分離血漿待用或保存。根據(jù)不同抗凝劑的性能特征，選擇合適的抗凝劑。實(shí)驗(yàn)室常用的抗凝劑有肝素的各種鹽、EDTA及枸櫞酸鈉。

 

1、肝素抗凝：

最常用的抗凝劑，一般情況下對(duì)相關(guān)指標(biāo)都不會(huì)有干擾，同時(shí)抗凝比例較大（抗凝劑：

全血=1:30），對(duì)血液基本沒有稀釋影響。

肝素是一種含有硫酸基團(tuán)的粘多糖，帶有強(qiáng)大的負(fù)電荷，具有加強(qiáng)抗凝血酶III滅活絲

氨酸蛋白酶的作用，從而阻止凝血酶的形成，并有阻止血小板聚集等多種抗凝作用。肝素管一般用于生化及血流變的檢測(cè)，是電解質(zhì)檢測(cè)的最佳選擇，檢驗(yàn)血標(biāo)本中的鈉離子時(shí)，不能使用肝素鈉，以免影響檢測(cè)結(jié)果。也不能用于白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類，因肝素會(huì)引起白細(xì)胞聚集。

盡管用肝素的三種鹽抗凝所得電解質(zhì)濃度無顯著差別，但肝素鋰還是被認(rèn)為是最好的。這主要是人們認(rèn)為肝素鈉可使鈉的測(cè)定值偏高，肝素銨可使血氨測(cè)定值偏高（尿素酶法測(cè)定）。

肝素可抑制分子生物學(xué)中常用的一些工具酶，如限制性內(nèi)切酶、Taq酶等，可影響PCR

的實(shí)驗(yàn)結(jié)果�？刹捎靡恍┓椒ㄏ�除肝素的抑制效應(yīng)，如利用肝素酶，或在分離白細(xì)胞后用緩沖液洗滌白細(xì)胞兩次以上等。然而，許多實(shí)驗(yàn)工作者仍不愿意在進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)采用肝素作抗凝劑。

2、EDTA抗凝：

乙二胺四乙酸是一種氨基多羧基酸，可以有效地鰲合血液中的鈣離子，鰲合鈣會(huì)將鈣從

反應(yīng)點(diǎn)移走將阻止和終止內(nèi)源性或外源性凝血過程，從而防止血液凝固，與其他抗凝劑比較而言，其對(duì)血球的凝集及血細(xì)胞的形態(tài)影響較小，故通常使用EDTA鹽(2K、3K、2Na)作為抗凝劑。用于一般血液學(xué)檢查，不能用于血凝、微量元素及PCR檢查。
    由于EDTA會(huì)螯合重金屬離子，用該抗凝劑的話，部分帶有金屬離子的大分子酶都會(huì)有大量損失，具體看客戶測(cè)定的指標(biāo)來選擇，做血常規(guī)的話必須用EDTA抗凝。

   3、枸櫞酸鹽抗凝:

檸檬酸鈉通過作用于血樣中鈣離子鰲合而起抗凝作用，國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)推薦為3.2％或3.8％，抗凝劑與血比例為1：9，主要用于纖溶系統(tǒng)(凝血酶原時(shí)間、凝血酶時(shí)間、活化部分凝血酶時(shí)間、纖維蛋白原)。采血時(shí)應(yīng)注意采足血量，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，采血后應(yīng)立即輕輕顛倒混勻5-8次。由于抗凝比例較�。�抗凝劑：全血=1:9），對(duì)血液有一定的稀釋，一般不建議。

選擇抗凝的注意點(diǎn)：

①、每一份樣本所加的抗凝劑的量要一致，同時(shí)所取的全血的量也要盡量一致;

②、收集抗凝全血后一定要輕輕顛倒，充分抗凝，防止部分血液未接觸到抗凝劑而導(dǎo)致凝固;

       ③、抗凝全血收集的血漿相對(duì)較多（1ml抗凝全血能分離出0.4-0.5ml血漿）;

       ④、抗凝收集的血漿冷凍保存后，解凍時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀渾濁，如有則需要離心去掉渾濁后

用于測(cè)定。

       血清、血漿收集好后，暫時(shí)不測(cè)定，可立即低溫凍存，溫度越低越好，中間如不反復(fù)凍融，-20℃以下可保存一個(gè)月,-70℃以下可保存三個(gè)月。

 

三、收集血清、血漿所用離心轉(zhuǎn)速：

   分離血清或血漿，根據(jù)種屬不同，離心轉(zhuǎn)速也有差異,推薦離心轉(zhuǎn)速為:

       ①、小鼠：一般1000-1500轉(zhuǎn)/分，離心8-10分鐘；

②、大鼠、兔子：一般2000-2500轉(zhuǎn)/分，離心8-10分鐘；

③、人：一般2500-3000轉(zhuǎn)/分，離心8-10分鐘。

四、高脂及溶血因素的影響:

溶血的影響:

溶血對(duì)某些檢驗(yàn)指標(biāo)的的影響不僅取決于所采用的方法，也取決于所用的分析儀器。采用雙

波長測(cè)定法可在一定程度上消除Hb的顏色干擾，然而Hb的干擾并不能完全消除，尤其是當(dāng)Hb可以與采用的試劑發(fā)生作用時(shí)�？偟膩碚f，輕微的溶血，對(duì)大多數(shù)臨床化學(xué)指標(biāo)的測(cè)定方法無明顯干擾。嚴(yán)重的溶血，可能有兩方面的影響：（1）測(cè)定成分在紅細(xì)胞內(nèi)的濃度高于血漿時(shí)，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高；（2）測(cè)定成分在RBC內(nèi)濃度低于血漿時(shí)，產(chǎn)生輕微的稀釋效應(yīng)。

用肉眼觀察標(biāo)本是否溶血只能是粗略的判斷。只有當(dāng)血清中血紅蛋白濃度超過20mg/dl時(shí)，

肉眼才能見到溶血情況。有人報(bào)導(dǎo)0.1％的紅細(xì)胞發(fā)生溶血后，其血清外觀與非溶血標(biāo)本一致；

1％紅細(xì)胞發(fā)生溶血后，血清清亮，呈櫻紅色，這樣的標(biāo)本就代表了中度溶血。

有人建議用血清Hb濃度來對(duì)溶血程度進(jìn)行判斷。非溶血標(biāo)本血清游離Hb為4.8±3.2mg/dl,中度溶血血清Hb為43.5±13.9mg/dl。即使輕微的溶血也可能導(dǎo)致相應(yīng)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果偏高(如LDH、ACP、K等)，這樣的標(biāo)本應(yīng)盡量避免使用。

高脂的影響:

高脂血癥所產(chǎn)生的混濁對(duì)某些指標(biāo)測(cè)定的影響，同樣取決于所采用的測(cè)定方法。一般而言，脂血通過樣品不均一性、水置換、親脂成分的吸收而影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。肉眼可見的脂血標(biāo)本可影響總蛋白的測(cè)定、電泳及色譜分析等。

五、全血或紅細(xì)胞的收集及保存

        測(cè)定全血或者是紅細(xì)胞中相關(guān)指標(biāo)的話，首先需要收集抗凝全血。

   全血：收集抗凝全血，輕輕顛倒充分抗凝后，可直接定量吸取全血，用冷蒸餾水制備溶血液后

用于不同指標(biāo)的檢測(cè)；也可定量吸取全血，轉(zhuǎn)入EP管，低溫凍存（溫度越低越好），測(cè)定

之前解凍并按比例加入冷蒸餾水制成溶血液用于檢測(cè)。

   紅細(xì)胞：收集抗凝全血，輕輕顛倒充分抗凝后，直接離心吸走血漿，留下層紅細(xì)胞，加入3倍

體積的生理鹽水，輕輕顛倒混勻，500～1000轉(zhuǎn)/分,離心5分鐘，棄上清留沉淀紅細(xì)胞,

重復(fù)2～3次,至上清液無色為止（洗滌紅細(xì)胞）。

        ①、直接定量吸取紅細(xì)胞，按比例加入冷蒸餾水制成溶血液待測(cè)；

②、定量吸取紅細(xì)胞，轉(zhuǎn)入EP管，立即低溫凍存（溫度越低越好），測(cè)定之前解凍，并按

比例加入冷蒸餾水制成溶血液用于檢測(cè)(解凍后部分紅細(xì)胞會(huì)破裂,因此樣本冷凍保存之

前必須進(jìn)行定量)。

    溶血液的制備：定量吸取紅細(xì)胞或者全血，按比例加入冷蒸餾水，充分漩渦混勻制備溶血液

(對(duì)光觀察，溶液澄清透亮,可顯微鏡觀察紅細(xì)胞是否破裂,如未破可延長混勻時(shí)間)，稀釋

成不同濃度用于不同指標(biāo)的檢測(cè)。