多肽合成技術(shù)中的片段合成法運(yùn)用之利拉魯肽的合成

利拉魯肽的結(jié)構(gòu)如圖 1 所示（賴氨酸 (Lys )側(cè)鏈親脂性基團(tuán)(N-棕櫚酰-γ-谷氨酸)的存在可以延長(zhǎng)藥物的半衰期）。
在利拉魯肽固相全合成的實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，N 端的第4個(gè)或者是第5個(gè)氨基酸常存在偶聯(lián)不完全的情況。需過(guò)量投料，其效率不高，不利于純化。
全保護(hù)片段縮合策略是對(duì)固相合成的一種補(bǔ)充，但對(duì)于片段較長(zhǎng)的情況，又存在全保護(hù)肽溶 解性差、反應(yīng)效率低的問(wèn)題。
 
絲氨酸/蘇氨酸對(duì)接法
絲氨酸/蘇氨酸對(duì)接法是在常規(guī)化學(xué)連接策略的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種片段對(duì)接方法。
與常規(guī)化學(xué)連接依賴硫酯和半胱氨酸(Cys)側(cè)鏈巰基(-SH)的特異性反應(yīng)不同；絲氨酸/蘇氨酸對(duì)接法主要依靠絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)側(cè)鏈羥基與醛基的亞胺捕獲反應(yīng)實(shí)現(xiàn)連接。
該方法的原理是將一個(gè)組分的C端轉(zhuǎn)化為水楊醛酯再與另一組N端絲氨酸/蘇氨酸反應(yīng)，所得中間體經(jīng)酸處理；N，O-苯亞甲基乙縮醛部分發(fā)生開環(huán)，脫去縮醛，變成肽鍵得到目標(biāo)產(chǎn)物。目前，這一策略主要應(yīng)用于糖肽、核蛋白及一些環(huán)狀肽的制備。
 
利用蘇氨酸對(duì)接法實(shí)現(xiàn)利拉魯肽片段組氨酸甘氨酸 ( His -Gly) 與片段蘇氨酸-甘氨酸 (Thr -Gly)的連接，合成了利拉魯肽的主鏈。先通N-芴甲氧羰基甘氨酸水楊醛酯(Fmoc-Gly-OSAL) 與蘇氨酸苯甲醇酯(H-Thr-OBzl)的模板反應(yīng)優(yōu)化了蘇氨酸對(duì)接反應(yīng)的條件，發(fā)現(xiàn)以醋酸/吡啶為溶劑時(shí)，底物轉(zhuǎn)化效率高。
研究了利拉魯肽片段對(duì)接的2種路線：
①先片段連接再進(jìn)行側(cè)鏈修飾；
②先修飾再進(jìn)行片段連接。
研究發(fā)現(xiàn)先進(jìn)行片段對(duì)接，再進(jìn)行側(cè)鏈修飾的路線效率更高，室溫下反應(yīng)4 h底物可完全轉(zhuǎn)化，中間體經(jīng)三氟乙酸(TFA)處理，一步完成開環(huán)與保護(hù)基的脫除，對(duì)接收率達(dá) 76. 4%。接著對(duì) Lys側(cè)鏈(N-棕櫚酰-γ-谷氨酸)的修飾反應(yīng)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在 pH=10～12的水/乙腈溶液中反應(yīng)時(shí)，能以較高的產(chǎn)率獲得目標(biāo)修飾產(chǎn)物。
1.
先片段對(duì)接，再進(jìn)行側(cè)鏈修飾
將其序列分割為全保護(hù)片段叔丁氧羰基-組氨酰(三苯甲基)-丙氨酰-谷氨酰(叔丁基)-甘氨酸［Boc-His(Trt)-Ala-Glu(tBu)-Gly-OH］和脫保護(hù)片段Thr-Gly，分別進(jìn)行合成。將全保護(hù)片段4的C端修飾為水楊醛酯，與片段6的N端Thr進(jìn)行對(duì)接。Lys側(cè)鏈修飾。
 
全保護(hù)肽Boc-His(Trt)-Ala-Glu(tBu)-Gly-OH合成:
以2-氯三苯甲基氯(CTC)樹脂為載體，采用芴甲氧羰基(Fmoc)策略進(jìn)行固相合成。在 DCM/AcOH體積比為95：5的條件下進(jìn)行裂解，減壓蒸除溶劑，得到油狀物1。
脫保護(hù)肽段Thr-Gly的合成:
以Wang樹脂為載體，采用Fmoc策略進(jìn)行固相合成，在TFA/TIS/H2O體積比為95∶2.5∶2.5的條件下進(jìn)行裂解，將反應(yīng)液加入冰乙醚中沉降，得到白色固體3。
四肽水楊醛酯的合成:
將化合物1溶于DCM中，加入DMAP、DIC、水楊醛和無(wú)水硫酸鈉，于30℃下攪拌反應(yīng)約4h過(guò)濾除去固體，濾液減壓蒸干，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化(乙酸乙酯/石油醚體積比為1∶5～4：1),得白色固體2。
按圖示路線合成化合物4～6。
對(duì)接中間體的合成:
將化合物2溶于醋酸/吡啶(摩爾比 3∶1)混合溶液中，加入肽段3，室溫下攪拌反應(yīng)約4 h。冷凍干燥除去溶劑，得粗產(chǎn)品油狀物4，不經(jīng)純化，直接用于下一步反應(yīng)。
線性肽組氨酸甘氨酸(His-Gly)的合成:
將化合物4粗產(chǎn)品溶于TFA/TIS/H2O(體 積比95∶2.5∶2.5)混合溶液中，室溫下反應(yīng) 40 min；反應(yīng)液經(jīng)半制備高效液相色譜(HPLC)純化(乙腈/水)，冷凍干燥得白色粉末5。
利拉魯肽的合成:
Pal-Glu-OtBu與N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)的酯化，得白色固體N-棕櫚酰-谷氨酸(γ-琥珀酰亞胺酯)叔丁酯［Pal-Glu(OSu)-OtBu]，不用純化直接使用。
將化合物5溶于水/乙腈(體積比3∶1)混合溶液中，加入DIEA調(diào)節(jié)溶液pH10～11。將Pal-Glu(OSu)-OtBu溶于乙腈中，逐滴加入到上述溶液中，滴加完畢，繼續(xù)反應(yīng)30 min。冷凍干燥除去溶劑，殘余物溶于TFA /H2O(體積比95∶5)混合溶液中，室溫下反應(yīng) 30 min。經(jīng)半制備 HPLC純化(乙腈/水)，冷凍干燥得白色粉末6，即利拉魯肽。
2.
先修飾后連接合成利拉魯肽
 
利拉魯肽側(cè)鏈修飾反應(yīng)
Lys的側(cè)鏈氨基與Pal-Glu(Osu)-OtBu進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到中間體，中間體經(jīng)酸處理脫除tBu保護(hù)基。由于精氨酸的側(cè)鏈胍基(pKa =12.5)有較強(qiáng)的堿性，可控制體系的pH在10～11范圍內(nèi)，使其質(zhì)子化，不與OSu酯發(fā)生反應(yīng); 序列中的其它堿性基團(tuán)，如N端氨基(pKa=9.5)，其親核性低于 Lys20側(cè)鏈氨基(pKa=10.5)，因此偶聯(lián)反應(yīng)會(huì)優(yōu)先發(fā)生在 Lys側(cè)鏈。
 
Thr-Gly側(cè)鏈修飾產(chǎn)物4的合成:
將化合物3溶于水/乙腈(體積比3∶1)混合溶液中，加入 DIEA 調(diào)節(jié)溶液pH10～11。將 Pal-Glu(OSu)-OtBu溶于乙腈中，逐滴加入到上述溶液中，滴加完畢，繼續(xù)反應(yīng) 30 min。經(jīng)半制備 HPLC 純化(乙腈/水)，冷凍干燥得白色粉末。
對(duì)接中間體5的合成:
將化合物2和四肽水楊醛酯溶于醋酸/吡啶(摩爾比3∶1)混合溶液中，室溫下反應(yīng)6 h．冷凍干燥除去溶劑，得粗產(chǎn)品油狀物5，不用純化，直接用于下一步反應(yīng)。
利拉魯肽的合成:
將化合物5粗產(chǎn)品溶于TFA /TIS /H2O(體積比95∶2.5∶2.5)混合溶液中，室溫下反應(yīng) 30 min;反應(yīng)液經(jīng)半制備HPLC純化(乙腈/水)，冷凍干燥得白色粉末產(chǎn)物利拉魯肽。
利拉魯肽(Liraglutide)是一種重要的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，于 2010 年被美國(guó)食
品藥品監(jiān)督管理局( FDA) 批準(zhǔn)上市，用于治療Ⅱ型糖尿病。
 
《蘇氨酸對(duì)接法合成利拉魯肽》