qPCR實驗的重要影響因素-抑制劑的使用與檢測方法
在決定實時熒光定量PCR檢測靈敏度、準(zhǔn)確性和可靠性的眾多因素中，模板質(zhì)量是決定重復(fù)性和生物學(xué)相關(guān)性的重要因素之一。諸多報告中也描述了生物樣品中常見的抑制成分會導(dǎo)致qPCR分析靈敏度和動力學(xué)的顯著降低。
如何檢測抑制劑：
多種方法可用于評估生物樣品中是否存在抑制劑。常用方法是通過連續(xù)稀釋樣品來評估樣品的PCR效率，PCR效率的高低一定程度上反映出樣品質(zhì)量的好壞。一個高效的PCR反應(yīng)要求擴增效率在90%-110%之間，當(dāng)擴增效率＞110%或＜90%，無論是相對定量還是絕對定量其最終結(jié)果都會不準(zhǔn)確。那么怎么來判斷是由于抑制劑引起的擴增效率異常呢？如圖1所示，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的狀態(tài)判斷，當(dāng)原液的數(shù)據(jù)點位于標(biāo)曲上方（紅色箭頭），則極有可能是樣本抑制劑抑制PCR反應(yīng)導(dǎo)致Cq值偏大。
內(nèi)部擴增控制（IACs）是一種與目標(biāo)核酸共純化和共擴增的方法，可用來檢測抑制劑和指示加工過程中的模板丟失。IACs可包裝在噬菌體外殼中，也可以是包含引物結(jié)合序列和探針檢測序列的單鏈寡核苷酸。在熒光信號采集過程中，探針結(jié)合位點的部分不匹配阻止了與IACs雜交，隨后可對熔解曲線進(jìn)行分析，用以區(qū)分IACs和目標(biāo)擴增子。IACs將是檢測病原體的優(yōu)質(zhì)方案，但這種方法不適用于細(xì)胞mRNA定量，因為考慮為每個單一mRNA設(shè)計模擬物是不現(xiàn)實的。
另外，也可以通過使用外源性對照來測試抑制劑，也稱為Spikes。該方法無論是在其構(gòu)造技術(shù)的復(fù)雜性方面，還是在分析之后與它們的準(zhǔn)確檢測相關(guān)的額外工作方面，相對都是比較簡單的。Spikes可以是RNA也可以是DNA分子，這取決于靶標(biāo)類型。mRNA表達(dá)分析首選RNA Spikes，DNA靶標(biāo)分析首選DNA Spikes。Spikes通常是幾千個堿基/堿基對異型序列，所以不會與任何已知目標(biāo)交叉反應(yīng)。
抑制劑類型：
抑制劑可以是核酸提取過程中使用的試劑，也可以是從生物樣品中提取的成分。抑制劑的影響，較好的情況是抑制劑會產(chǎn)生不準(zhǔn)確的定量結(jié)果；最壞的情況是高度抑制會產(chǎn)生假陰性結(jié)果。常見的抑制劑類型如下：
1）樣品本身的成分：許多生物樣品本身就含有嚴(yán)重抑制逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)的成分，如血液中的血紅蛋白、免疫球蛋白G，肌肉中的肌紅蛋白、膽鹽、腐殖酸、尿素和膠原蛋白，植物中的多糖多酚等。
2）提取和純化試劑的成分：許多用于純化核酸的試劑，如苯酚、氯仿、硫氰酸胍、鹽酸胍、乙二胺四乙酸、二甲基亞砜、十二烷基硫酸鈉、噻唑、三唑和核糖核酸等。
如何降低抑制劑的影響：
當(dāng)樣本中存在抑制劑，高濃度模板中抑制劑濃度較高，對PCR反應(yīng)的影響較大。低濃度模板由于稀釋使得抑制劑濃度有所下降，抑制劑的抑制作用也相應(yīng)降低。如果是樣品本身的成分，可對模板進(jìn)行稀釋，或者進(jìn)一步純化，又或者改進(jìn)提取方法來降低抑制劑的干擾。如果提取和純化試劑的成分，其本身就是最有效的逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)的抑制劑，因此需要在提取和純化過程中注意對試劑成分的去除，防治污染模板。
Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)
Azure Cielo™ 實時熒光定量PCR系統(tǒng)來自美國Azure Biosystems公司，可為您提供3/6檢測通道，根據(jù)實驗需求靈活配置。這款產(chǎn)品采用了高能LED作為光源系統(tǒng)，可保證光源強度高，光源一致性好；高品質(zhì)的帕爾貼溫度模塊作為溫控系統(tǒng)，升降溫速率快，可設(shè)置12列跨度30°C的溫度梯度；卓越的CMOS拍照+光纖信號傳輸作為檢測系統(tǒng)，CMOS檢測靈敏度高，光纖傳輸速度快，無光損失和噪音干擾，無需ROX校準(zhǔn)。Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)可為您的科學(xué)研究提供高精準(zhǔn)度、高靈敏度和高可靠性的實驗結(jié)果。
☑ 數(shù)據(jù)可靠性：連續(xù)1000次實驗后，結(jié)果高度一致。
☑ 應(yīng)用靈活性：提供多種qPCR應(yīng)用分析。
☑ 流程智能化：中英文用戶界面，觸控操作，可多機聯(lián)用。
☑ 在線便捷性：主機可獨立運行qPCR程序，數(shù)據(jù)可USB、Wi-Fi等網(wǎng)絡(luò)傳輸。
