考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度的原理、步驟及注意事項

蛋白質濃度測定的方法有很多，考馬斯亮藍測定蛋白質是實驗室最常見的一種方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作簡便，下文介紹了考馬斯亮藍測定蛋白質濃度的原理、優(yōu)缺點、操作以及注意事項。

實驗原理
考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質―染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。

考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm變?yōu)?595 nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。通過測定595 nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合。

考馬斯亮藍染色法的突出優(yōu)點是：
(1)靈敏度高，據(jù)估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1 mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大，蛋白質-染料復合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。
(2)測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。
(3)干擾物質少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。

此法的缺點是：
(1)由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍染色法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用g—球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。
(2)仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)等。

試劑與器材
一、試劑
考馬斯亮藍試劑：
考馬斯亮藍G―250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000 mL。
二、標準和待測蛋白質溶液
1. 標準蛋白質溶液
結晶牛血清蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用0.15 mol/L NaCl配制成1 mg/mL蛋白溶液。
2. 待測蛋白質溶液。
人血清，使用前用0.15 mol/L NaCl稀釋200倍。
三、器材
試管1.5×15 cm(×6)，試管架，移液管管0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒溫水浴;分光光度計。

操作方法
一、制作標準曲線
取7支試管，按下表平行操作。

試管編號
0  1  2  3  4  5  6

標準蛋白溶液（mL）
0  0.01  0.02  0.03  0.04  0.05  0.06  0.15mol/LNaCl（mL）
0.1  0.09  0.08  0.07  0.06  0.05  0.04

考馬斯亮藍試劑5 mL搖勻，1h內以0號管為空白對照，在595 nm處比色繪制標準曲線：以A595 nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。

二、未知樣品蛋白質濃度測定
測定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測定值在標準曲線的直線范圍內。根據(jù)所測定的A595 nm值，在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。

注意事項
在試劑加入后的5-20 min內測定光吸收，因為在這段時間內顏色是最穩(wěn)定的。

測定中，蛋白-染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。

利用考馬斯亮藍法分析蛋白必須要掌握好分光光度計的正確使用，重復測定吸光度時，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標準曲線的時候，蛋白標準品最好是從低濃度到高濃度測定，防止誤差。