Western及IP細胞裂解液(無抑制劑)使用說明

1.對于培養(yǎng)細胞樣品：
a.融解Western及IP細胞裂解液(無抑制劑)，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據(jù)實驗需要加入適當(dāng)?shù)纳鲜龅鞍酌噶姿崦敢种苿┗旌衔铩?BR>b.對于貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸動物細胞1-2秒后，細胞就會被裂解。植物細胞宜在冰上裂解2-10min。
對于懸浮細胞：離心收集細胞，輕輕vortex或者彈擊管底以把細胞盡量分散開。按照6孔板每孔細胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。輕彈管底以充分裂解細胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成50-100萬細胞/管，然后再裂解。大團的細胞較難裂解充分，而少量的細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。
對于細菌或酵母：對于1ml菌液或酵母液，離心去上清，如果有必要可以使用PBS洗滌一次，充分去除液體后，輕輕vortex或者彈擊管底以把細菌或酵母盡量彈散。加入100-200微升裂解液，輕輕vortex或者彈擊管底以混勻，冰上裂解2-10min。如果希望獲得更好的裂解效果，細菌和酵母可以分別使用溶菌酶和破壁酶(Lyticase)消化，然后再使用本裂解液進行裂解。
裂解液用量說明：通常6孔板每孔細胞或者1ml的菌液或酵母液中的細菌和酵母量加入100微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到150微升或200微升。每100萬動物細胞用100微升本產(chǎn)品裂解后獲得的上清，其蛋白濃度約為2-4mg/ml，不同細胞有所不同。
c.充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀、免疫共沉淀、酶或生物小分子檢測等操作。

2.對于組織樣品：
a.把組織剪切成細小的碎片。
b.融解Western及IP細胞裂解液(無抑制劑)，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據(jù)實驗需要加入適當(dāng)?shù)纳鲜龅鞍酌噶姿崦敢种苿┗旌衔铩?BR>c.按照每20毫克組織加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)
d.用玻璃勻漿器勻漿，或使用生產(chǎn)的E6600 TissueMaster™手持式組織研磨儀研磨，直至充分裂解。也可以把組織樣品冷凍后液氮研磨，研磨充分后加入裂解液進行裂解。
e.充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。每20mg凍存的小鼠肝臟組織用200微升本裂解液裂解后獲得的上清，其蛋白濃度約為15-25mg/ml，不同狀態(tài)的不同組織有所不同。
f.如果組織樣品本身非常細小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器或研磨設(shè)備，缺點是不如勻漿或研磨那樣裂解比較充分。

附錄：生產(chǎn)的各種裂解液主要特點、差異和選擇
首先請參考下表，了解各種裂解液的主要特點和差異。