外周血單個核細胞（PBMC）制備方法及注意事項

外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞（Lymphocyte）、單核細胞（Monocyte）、樹突狀細胞（DC）和其他少量細胞。PBMC可利用健康人或動物供體的外周血，通過Ficoll密度梯度離心，磁珠分選等步驟獲得，主要包括淋巴細胞和單核細胞。

Ficoll是蔗糖的多聚體，中性，平均分子量400,000，當密度為1.2g/mL，未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。

 

人PBMC中不同細胞類型的比例
PBMC中大部分都是淋巴細胞，包括B細胞和T細胞，其中CD3+T細胞又占了淋巴細胞中絕大部分(45-70%)。這些T細胞都處于初始（naive）狀態(tài)，即已經(jīng)成熟了但沒有受到抗原刺激。 在正常人中，只有非常小的一部分初始T細胞會因抗原識別而被激活。同樣的B細胞也都處于初始狀態(tài)。相對于淋巴細胞，單核細胞的比例在10-30%，收到刺激之后會發(fā)育成樹突狀細胞(DC)或巨噬細胞。干細胞的比例非常低，只有0.1-0.2%，因此很難從全血樣本中分離到。

一、外周血單個核細胞（PBMC）制備方法
1.設(shè)備與試劑
全血 （以10ml為例）
無菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理鹽水
蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)
RPMI 1640培養(yǎng)基 （Invitrogen）
胎牛血清（FBS）（GIBCO）
雙抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亞砜（DMSO）（SIGMA）
預先裝好異丙醇的凍存盒

2.方法/步驟
配制所需的溶液：
a. 細胞培養(yǎng)基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 細胞凍存液：FBS中加入10%DMSO；

（1）在離心管中加入淋巴細胞分離液Ficoll
（2）取抗凝外周血（全血）與無菌PBS按照1:1充分混勻，用移液管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，動作一定要輕，注意保持清楚的界面。外周血，PBS，淋巴細胞分離液最終體積比為1:1:1。
（3）水平離心400g×30分鐘（可根據(jù)淋巴細胞分離液Ficoll或離心機轉(zhuǎn)子要求調(diào)整）
（4）離心后可看見管內(nèi)分為三層，上層為血漿和PBS，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液。在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，主要就是單個核細胞，包括淋巴細胞與單核細胞。此外，還含有血小板。
（5）去除部分上層液體，余下約1mL，用移液器插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一離心管中，加入5倍以上體積的PBS，離心300g×10分鐘，洗滌細胞兩次。
（6）末次離心后，棄上清，加入紅細胞裂解液，室溫孵育2分鐘，裂解紅細胞，可根據(jù)情況適當增減時間。
（7）加入10mLPBS，離心300g×10分鐘，洗滌細胞兩次。
（8）末次離心后，棄上清，加入含有10%FBS的RPMI1640，重懸細胞，計數(shù)，計算細胞活力。

注意事項
全血溶液可以加在Ficoll上層或者下層，但是最終都必須保證兩種溶液分層清晰。
分離PBMC第一步離心的時候，一定不能設(shè)置低水平的制動。否則將分層混亂。

細胞運輸與保存
（1）干冰運輸，收到細胞后立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復蘇；
（2）T25瓶運輸細胞，收到后應(yīng)繼續(xù)生長，傳代達到細胞生長狀態(tài)良好時，再進行凍存，具體操作步驟見細胞培養(yǎng)步驟。

PBMC收到后注意事項：
（1）收到PBMC細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時反饋。
（2）先不打開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放培養(yǎng)箱靜置四小時，穩(wěn)定細胞狀態(tài)，切忌在溫箱內(nèi)靜置過夜。
（3）靜置后鏡檢，拍照，記錄細胞狀態(tài)。建議傳代后也拍照記錄細胞生長情況。
（4）貼壁細胞：若細胞密度超過80%，可正常傳代；若未超過80%，收集細胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)基，留8ml繼續(xù)培養(yǎng)至80%左右再傳代，瓶蓋可稍微擰松。
（5）細胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)基含血清和雙抗，可收集后4℃保存?zhèn)溆�，可補加2%血清。剛開始傳代時建議一半用細胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)基，一半用自備的培養(yǎng)基，使細胞逐漸適應(yīng)培養(yǎng)條件，以免因不適應(yīng)而造成生長狀態(tài)不佳。
（6）細胞胰酶消化液建議使用PBS配制。

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不同種屬PBMC：人，猴，犬，大鼠，小鼠

貨號    產(chǎn)品    狀態(tài)
0621011/0621012    人外周血單個核細胞PBMC    Fresh/Frozen
0621021/0621022    猴外周血單個核細胞PBMC    Fresh/Frozen
0621031/0621032    比格犬外周血單個核細胞PBMC    Fresh/Frozen
0621041/0621042    大鼠外周血單個核細胞PBMC    Fresh/Frozen

0621051/0621052    小鼠外周血單個核細胞PBMC    Fresh/Frozen