輔料、貯存、以及配方條件對注射用蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定性的影響

為什么蛋白質(zhì)與包裝容器之間的相互作用很重要？
在制造、存儲和運(yùn)輸過程中，注射用蛋白質(zhì)藥物會接觸到金屬、玻璃、油和聚合物等多種表面和材料。從最初的蛋白合成用的不銹鋼容器，到最后注射入人體前的玻璃針管都會涉及。蛋白質(zhì)固有的表面活性可導(dǎo)致它們與表面相互作用，從而產(chǎn)生可能的變性和后期聚集。這種聚集會產(chǎn)生與安全相關(guān)的問題，例如不良的免疫反應(yīng)，不良的交叉反應(yīng)或功效喪失。
   
輔料蛋白質(zhì)保護(hù)機(jī)制
輔料（賦形劑）是蛋白質(zhì)制劑的添加劑，有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并最大程度地減少潛在的有害聚集、級聯(lián)反應(yīng)。它們的范圍從簡單的緩沖液到更復(fù)雜的成分如氨基酸，糖，表面活性劑和抗氧化劑等。表面活性劑或表面活化物質(zhì)，在決定蛋白質(zhì)通過潛在的三種可能機(jī)制與表面相互作用中起主要作用（圖1）：
 

1. 共配制：藥物制劑中的表面活性劑/活化物質(zhì)在蛋白質(zhì)分子上形成保護(hù)層，從而防止它們粘附到容器表面上。
2. 表面相互作用：表面活性劑/活化物質(zhì)在容器表面形成保護(hù)層并抑制蛋白質(zhì)吸附。
3. 蛋白質(zhì)相互作用：表面活性劑/活化物質(zhì)與吸附的蛋白質(zhì)相互作用并將其從表面去除。

  圖1：代表表面活性劑/活化物質(zhì)保護(hù)藥物蛋白質(zhì)的三種可能機(jī)理的示意圖：共配制，表面相互作用和蛋白質(zhì)相互作用。
 
QSense QCM-D如何幫助量化蛋白質(zhì)表面吸附?
表面敏感的QSense耗散型石英晶體微天平（QCM-D）技術(shù)可用于評估蛋白質(zhì)如何與生產(chǎn)容器，加工材料（例如過濾器），儲存容器或運(yùn)輸裝置相互作用。QCM-D是一種基于石英壓電效應(yīng)傳感器的表面技術(shù)，可實(shí)時(shí)監(jiān)控表面的納米/納克級變化。
 
由于可以在QCM-D傳感器上準(zhǔn)備多種不同的表面材料，輕松研究各種不同材料的性質(zhì)便成為了可能。該技術(shù)可以量化與表面相互作用的蛋白質(zhì)的量（質(zhì)量和厚度），以及由于蛋白質(zhì)溶液和QCM-D傳感器之間的相互作用而導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)（粘彈性）特性變化�？梢栽u估賦形劑的存在及其他配方條件例如濃度，pH或緩沖液類型等等，對吸附特性的影響。類似如溫度波動，pH值變化或攪拌之類的壓力同樣可以很容易被探測到。
 
QSense提供了多種現(xiàn)成的傳感器表面，可模仿各種存儲罐，過濾器和運(yùn)輸表面材料。QSense可提供定制的表面，以滿足特定的工業(yè)需求。下面是瑞典百歐林當(dāng)前提供的與制藥相關(guān)的QCM-D傳感器列表：
 
制藥相關(guān)的QCM-D傳感器列表：

塑料包裝	包袋
聚丙烯，PP 聚氯乙烯，PVC 聚對苯二甲酸乙二醇酯，PET 聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA	環(huán)烯烴聚合物，COP 環(huán)烯烴共聚物，COC
玻璃容器	過濾材料
硼硅酸鹽玻璃（小瓶，注射器，實(shí)驗(yàn)室用具） 鈉鈣玻璃	聚偏二氟乙烯PVDF 聚四氟乙烯，PTFE 聚碳酸酯，PC 聚醚砜，PES 聚對苯二甲酸乙二醇酯改性的PET-G
預(yù)填裝注射器	其他相關(guān)材料
聚二甲基硅氧烷 PDMS 硅油	聚苯乙烯 纖維素 不銹鋼 尼龍 聚氨酯 醋酸纖維素 聚丙烯腈

注：可根據(jù)要求定制傳感器表面。
 
演示案例：如何使用QCM-D量化蛋白質(zhì)-表面相互作用
在本案例研究中，存在/不存在藥物制劑聚山梨酯20（PS20）的條件下，模型蛋白溶菌酶被吸附在聚偏二氟乙烯（PVDF），聚苯乙烯（PS），聚四氟乙烯（PTFE）和不銹鋼上。
 
PVDF通常用作蛋白質(zhì)溶液的過濾材料。PS用來模仿診斷儀器和一次性實(shí)驗(yàn)室用具如培養(yǎng)皿，組織培養(yǎng)容器，燒瓶和移液器。PTFE由于出色的化學(xué)相容性和耐熱性，已用于各種應(yīng)用包括過濾器，閥門，配件，密封件，墊圈，儲罐，容器和管道。不銹鋼來模擬生產(chǎn)容器表面。
 
在PBS緩沖液中制備10mg/mL（1％）的溶菌酶，0.05％聚山梨酯20（PS20）（V/V）。使用蠕動泵將溶液以100µL/min的流速泵入QSense QCM-D儀器中。
 
在每種類型的表面上進(jìn)行了以下4組實(shí)驗(yàn)（括號定義吸附機(jī)理）：
 

1. PBS基線→溶菌酶+PS20混合物的吸附→PBS緩沖液洗滌（共配制）
2. PBS基線→PS20→溶菌酶→PBS緩沖液洗滌（表面相互作用）
3. PBS基線→溶菌酶→PS20→PBS緩沖液洗滌（蛋白質(zhì)相互作用）
4. PBS基線→溶菌酶→PBS緩沖液洗滌（對照）

 
QCM-D實(shí)時(shí)監(jiān)控兩個(gè)參數(shù)：頻率（f）和能量耗散（D）。頻率與質(zhì)量變化有關(guān)：頻率下降表示物質(zhì)吸附。耗散與吸附物質(zhì)的柔軟度或粘彈性有關(guān)：耗散增加表示吸附物質(zhì)較為柔軟。耗散與頻率D/f的比值可以提供與蛋白質(zhì)變性有關(guān)的有價(jià)值信息。
 
吸附表面的影響：
結(jié)果表明，表面組分顯著影響蛋白質(zhì)的吸附量（圖2）。在親水性不銹鋼上吸附量最高，而在疏水性PTFE上吸附量最低（圖2c和2d）。
 
表面活性劑的影響：
當(dāng)PS20存在時(shí)，無論是其在溶液中還是預(yù)先吸附在表面上，都大大降低了PVDF和聚苯乙烯表面上的蛋白質(zhì)吸附（圖2a和2b）。相反地，在PTFE和不銹鋼表面上并未觀察到PS20的顯著吸附（圖2c-2d）。
 
當(dāng)將表面活性劑混合到藥物制劑中（共配制）時(shí)，其表面保護(hù)作用類似于表面上預(yù)先吸附的表面活性劑層（表面相互作用）。通過PS20（蛋白質(zhì)相互作用）對吸附的蛋白質(zhì)層進(jìn)行后處理不會導(dǎo)致明顯的蛋白質(zhì)去除。
 
耗散與頻率比值（D/f）：
（D / f）在圖2中顯示為紅色“x”，提供了有關(guān)吸附物質(zhì)柔軟度的信息。吸附質(zhì)量的任何結(jié)構(gòu)變化，例如由于添加表面活性劑，會改變該比例的變化。在不銹鋼表面上，所有條件下D / f均保持恒定且較低，這表明吸附的物質(zhì)是剛性的，并且不受表面活性劑的影響（圖2d）。由于可能變性的蛋白質(zhì)構(gòu)型，已經(jīng)形成了剛性結(jié)構(gòu)。在聚合物表面上，當(dāng)存在PS20時(shí)，D / f增加（圖2a，2b和2c），表明在表面活性劑存在下，這些表面上的吸附物質(zhì)相對較軟。
  圖2：在（a）PVDF，（b）聚苯乙烯，（c）PTFE，（d）不銹鋼上存在/不存在聚山梨酯20的情況下，溶菌酶吸附的頻率（質(zhì)量）變化和D / f值（3倍頻的D / f）。
 
柱狀圖的總高度代表緩沖液洗滌之前的總質(zhì)量吸附，較淺的陰影部分表示緩沖液洗滌后被洗去的質(zhì)量，較深的陰影部分表示緩沖液洗滌后的殘留質(zhì)量。（數(shù)據(jù)來自瑞典百歐林。）
可以發(fā)現(xiàn)聚山梨酯20和蛋白質(zhì)保護(hù)作用機(jī)制取決于所討論的表面材料。這個(gè)例子說明了表面活性劑如何通過在蛋白質(zhì)和材料表面之間形成保護(hù)性屏障來保護(hù)蛋白質(zhì)不與表面相互作用。該數(shù)據(jù)還可能揭示當(dāng)吸附到特定表面（如不銹鋼）上時(shí)蛋白質(zhì)會變性，以及進(jìn)一步表面相互作用時(shí)可能發(fā)生聚集的風(fēng)險(xiǎn)。
 
使用QSense QCM-D研究醫(yī)藥相關(guān)TOP 5的文章
許多出版物中已經(jīng)報(bào)道了使用QCM-D技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域中的相關(guān)研究。在這里，我們列出了TOP5文章，供讀者參考。

1. J. Li et al. “Mechanistic Understanding of Protein-Silicone Oil Interactions” Pharm Res 2012, 29 (6), 1689-1697. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22350802
2. S. Zheng et al. “Particle Characterization for a Protein Drug Product Stored in Pre-Filled Syringes Using Micro-Flow Imaging, Archimedes, and Quartz Crystal Microbalance with Dissipation” The AAPS Journal 2017, 19 (1), 110-116. https://link.springer.com/article/10.1208/s12248-016-9983-1
3. A. Oom et al. “Surface interactions of monoclonal antibodies characterized by quartz crystal microbalance with dissipation: Impact of hydrophobicity and protein self‐interactions” J Pharm Sci 2011, 101(2): 519-529 https://doi.org/10.1002/jps.22771
4. Wiseman ME, et al. “Antibody adsorption and orientation on hydrophobic surfaces” Langmuir 2012 28:1765–1774. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/la203095p
5. J. Li et al. “Adsorption of polypropylene oxide-polyethylene oxide type surfactants at surfaces of pharmaceutical relevant materials: effect of surface energetics and surfactant structures” Phar Dev Technol 2019 24:70-79 https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/10837450.2018.1425431