CAR-T 在體內(nèi)的示蹤研究中的應(yīng)用

（一） 賓大發(fā)表 CAR-T 示蹤研究論文
賓夕法尼亞大學(xué) Perelman 醫(yī)學(xué)院通過使用 MOLECUBES PET/CT 模塊化臺(tái)式小動(dòng)物成像系統(tǒng)， 2020 年 1 月在《Molecular Therapy》上發(fā)表了論文《Imaging CAR T CellTrafficking with eDHFR as a PET Reporter Gene》，揭示如何利用 PET/CT 進(jìn)行小鼠體內(nèi)的 CAR-T 示蹤研究【1】。
圖 1. 賓夕法尼亞大學(xué)發(fā)表的論文。

（二） 如何設(shè)計(jì) PET 報(bào)告基因？

目前 CAR-T 和 TCR-T 細(xì)胞治療已經(jīng)越來越成熟，但我們?nèi)绾沃�道此治療�?xì)胞在體內(nèi)到達(dá)了靶點(diǎn)，而非到達(dá)其他部位引發(fā)毒性反應(yīng)？ 賓大的研究者設(shè)計(jì)出一種 PET 報(bào)告基因： [18F]-TMP-eDHFR（[18F]-TMP： 氟代甲氧芐胺嘧啶； eDHFR： 二氫葉酸還原酶）， TMP 和 eDHFR 的生化結(jié)構(gòu)保證了小分子 TMP 和蛋白質(zhì) eDHFR 能相互作用，從而緊密結(jié)合在一起。將轉(zhuǎn)染 DYR 質(zhì)粒（DYR： eDHFR-YFR-Renilla； YFP：黃色熒光蛋白； Renilla luciferase：熒光素酶）的腫瘤細(xì)胞移植在小鼠體內(nèi)，再從小鼠尾靜脈注射[18F]-TMP， 特定時(shí)間后對(duì)小鼠進(jìn)行 PET 成像，就可以顯示出腫瘤細(xì)胞的位置。 同時(shí)熒光素酶的加入，使生物發(fā)光成像（BLI） 也成為可能。


圖 2. PET 報(bào)告基因（[18F]-TMP-eDHFR）的結(jié)構(gòu)。

如果用靶向 GD2（雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯）的 CAR 慢病毒和帶 DYR 質(zhì)粒的慢病毒同時(shí)轉(zhuǎn)染 T細(xì)胞，就可以得到轉(zhuǎn)染了 eDHFR 的 DYR-CAR T cell，注射 DYR-CAR T cell 到移植了 GD2+和 GD2-的腫瘤細(xì)胞的小鼠體內(nèi)， 通過從小鼠尾靜脈注射[18F]-TMP 核素， 就可以跟蹤 CAR
T cell 是否靶向 GD2+的腫瘤細(xì)胞。 靶向 GD2+的 CAR-T 療法， 可治療兒科腫瘤如成神經(jīng)細(xì)胞瘤和骨肉瘤。



圖 3. DYR 質(zhì)粒和 CAR 質(zhì)粒示意圖【1】。

（三） 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測[18F]-TMP 和 eDHFR 的結(jié)合力方法： 表達(dá) eDHFR-YFP 的 HCT116 cells（人結(jié)腸癌細(xì)胞） 和無轉(zhuǎn)導(dǎo)（NTD） HCT116 cells
（對(duì)照組） 分別移植到 CD1 nu/nu 小鼠的雙肩，生長 3 周（圖 4， C 圖）； [18F]-TMP 從尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)； 注射后 3h 和 6h 進(jìn)行 PET 成像（圖 4， D 圖和 E 圖）。結(jié)論（1）： eDHFR tumor 攝取更多的[18F]-TMP；對(duì)照組基本無攝取。



圖 4. 小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測[18F]-TMP 和 eDHFR 的結(jié)合力【1】。

結(jié)論（2）： 小鼠不同臟器部位的放射信號(hào)強(qiáng)度表示[18F]-TMP 的攝入量：eDHFR tumor 攝取更多的[18F]-TMP，其他重要器官（如心臟、肌肉、 肺、 脾臟、腦部，等） 攝入低，靈長類骨髓、腸道攝入低（圖 5， A 圖）。腫瘤和肌肉的放射信號(hào)強(qiáng)度比表示： eDHFR tumor 明顯高于 Control Tumor（圖 5， B 圖）。 說明此方法背景值低，方法靈敏。



圖 5. 小鼠不同臟器部位的信號(hào)強(qiáng)度表示[18F]-TMP 的攝入量【1】。

3.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示 CAR T cell 的跟蹤
用流式細(xì)胞儀可根據(jù) YFP 和 mCherry 的不同表達(dá)分選出不同細(xì)胞群進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)：
（1）雙陽性 DYR-CAR T cell；
（2）單陽性的對(duì)照的 DYR-only T cell、 CAR-only T cell。

方法： 小鼠進(jìn)行肩部皮下異體腫瘤移植： 小鼠：免疫缺陷的人源化的 NSG mice； 腫瘤為：GD2+腫瘤（143b 人骨肉瘤） 和 GD2-對(duì)照腫瘤（HCT116 人結(jié)腸癌細(xì)胞） 對(duì)比； 腫瘤生長 14天后從尾靜脈注射 DYR-CAR T cell 或 control DYR-only T cell； 在 T cell 注射之后的第 7 天和第 13 天成像，開始是尾靜脈注射腔腸素后進(jìn)行生物發(fā)光成像（BLI），然后尾靜脈注射[18F]-TMP 進(jìn)行 PET/CT 成像。



圖 6. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)流程圖【1】。

結(jié)論（1）： GD2+ 143b tumor 研究： DYR-CAR T cell 的比值在第 13 天增加，而 Control DYR T cell 的比值均未增加（圖 7， D 圖）。小鼠 M4： BLI 顯示：第 7 天時(shí)脾臟有信號(hào)，在第 13 天時(shí)信號(hào)聚集在 GD2+ tumor 中； PET 顯示：紅色箭頭為腫瘤內(nèi)的 T cell 的聚集（圖7， E 圖）。 DYR-CAR T cell 聚集在 GD2+ tumor 中。



圖 7. GD2+ 143b tumor 研究： DYR-CAR T cell 聚集在 GD2+ tumor 中【1】。

結(jié)論（2）： GD2- HCT116 tumor 研究： DYR-CAR T cell 的比值和 Control DYR T cell 的比值均未增加（圖 8， F 圖）。 小鼠 M3： BLI 顯示：脾臟熒光第 13 天已減弱，信號(hào)出現(xiàn)在腫瘤上（圖 8， A 圖）； PET 顯示： GD2+信號(hào)強(qiáng)， GD2-信號(hào)弱（圖 8， B 圖）。 DYR-CAR T cell
不會(huì)聚集在 GD2- tumor 中。



圖 8. GD2- HCT116 tumor 研究： DYR-CAR T cell 不會(huì)聚集在 GD2- tumor 中【1】。

詳細(xì)實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果，請參考原文。

（四） 實(shí)驗(yàn)的意義

本文開發(fā)了一種 PET 成像技術(shù)利用[18F]-TMP 和 eDHFR 作為報(bào)告基因進(jìn)行 CAR T cell的追蹤。

PET 成像信號(hào)來自： DYR-CAR T cells ， CAR 是 T cells 增殖和示蹤的關(guān)鍵，可以檢測僅有 11,000 CD8 DYR-CAR T cells per mm3 的腫瘤組織，方法靈敏度高于其他 PET 示蹤技術(shù)， 如： human norepinephrine transporter (hNET) 和 herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk)。本方法可以對(duì)生物工程細(xì)胞進(jìn)行長期（數(shù)周到數(shù)月）的追蹤，是短期標(biāo)記追蹤技術(shù)（如 Zr-89 或 In-111 oxine）的有力補(bǔ)充。 【1】對(duì)人體內(nèi)的少量基因改造細(xì)胞，如 CAR T cell 進(jìn)行成像是加速從新細(xì)胞治療技術(shù)到臨床實(shí)踐轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵�？杉訌�(qiáng)我們對(duì)治療成功、失敗和毒性的理解和認(rèn)知。

適合做 CAR T cell 示蹤的 PET 必須具有高分辨率、高靈敏度、低劑量等優(yōu)勢。 比利時(shí)MOLECUBES PET/CT 模塊化臺(tái)式小動(dòng)物分子影像系統(tǒng)是市面上為數(shù)不多滿足這些要求的PET/CT 系統(tǒng)。

（五） MOLECUBES PET/CT 介紹

5.1 儀器技術(shù)介紹

MOLECUBES 成立于比利時(shí)根特大學(xué)（比利時(shí)學(xué)術(shù)排名第一）， 采用先進(jìn)的小動(dòng)物活體成像技術(shù)/核醫(yī)光電技術(shù)及光學(xué)材料，將原本體積巨大、笨重的 PET/SPECT/CT 儀器設(shè)計(jì)成結(jié)構(gòu)緊湊、運(yùn)輸安裝方便的臺(tái)面式儀器，同時(shí)提供高分辨率和高靈敏度，是市面上可做整只大鼠全身成像的桌面式 PET/SPECT/CT【 2】。



圖 9. MOLECUBES 的模塊化臺(tái)式小動(dòng)物 PET/CT。

MOLECUBES 為模塊化設(shè)計(jì)， PET、 SPECT、 CT 為獨(dú)立的儀器。 PET、 SPECT 為功能性成像，CT 為結(jié)構(gòu)性成像，可組成 PET-CT、 SPECT-CT、 PET-SPECT-CT 等多種模態(tài)，同時(shí)提供功能性和結(jié)構(gòu)性信息。

模塊化的優(yōu)勢有： 各模塊具有功能表現(xiàn)、圖像完美自動(dòng)配準(zhǔn)、速度快、通量高、可任意升級(jí)組合、維修不影響其他模塊、占地小、安裝易、運(yùn)輸方便，等。

MOLECUBES PET/SPECT/CT 的優(yōu)勢及特點(diǎn)有【2】 ：
1、 PET 采用先進(jìn)的連續(xù)型單體閃爍晶體和 SiPM 耦合技術(shù)，和臨床 PET 趨勢一致； NEMA數(shù)據(jù)（空間分辨率、能量分辨率、靈敏度，等）業(yè)界好【3】 。
2、 SPECT 具有專利的準(zhǔn)直器，高分辨率、高靈敏度，可使用三種不同放射核素同時(shí)成像。
3、 CT 為 360 度滑環(huán)結(jié)構(gòu)，和臨床 CT 趨勢一致；可以極低放射劑量掃描。
4、都可做高通量掃描（同時(shí) 4 只小鼠）。
5、操作步驟在 10 步以內(nèi)，簡單易學(xué)。
6、 2016 年投產(chǎn)以來已在全球銷售 60+臺(tái)，遠(yuǎn)超其他同類產(chǎn)品。

PET 探測器技術(shù)采用連續(xù)型單體閃爍晶體與硅光電倍增器系統(tǒng)相耦合 ( LYSO cont./SiPM)：即晶體為整體材料，無需由多個(gè)小晶體拼接而成，單晶使探測器能夠更準(zhǔn)確的獲得光子在閃爍晶體中能量沉積的位置與時(shí)間(DOI， Depth of Interaction)， 具有更高的光子探測效率，提高系統(tǒng)的空間分辨率、時(shí)間分辨率、靈敏度，進(jìn)而提高系統(tǒng)的成像質(zhì)量。與臨床 PET 的發(fā)展方向保持一致。 而其他品牌的 PET 仍然采用傳統(tǒng)的像素化多晶體，分辨率有限，靈敏度低，成本高。此外，硅光電倍增器（SiPM）與光電倍增管（PMT）相比，能在更低的電壓下提供更高的增益和更快的反應(yīng)，光電轉(zhuǎn)化效率更高，是更新、更先進(jìn)的技術(shù)（圖10） 。 MOLECUBES 使用的連續(xù)型單晶體具有高光子吸收效率【2】 。



圖 10. 連續(xù)型單體閃爍晶體和 SiPM 耦合（左圖），像素型多晶體和 PMT 耦合（右圖）。

根據(jù) NEMA 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NEMA 即美國電氣制造商協(xié)會(huì)， 成立于 1926 年， 由美國 560 家主要電氣制造廠商組成， NEMA 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為不同生產(chǎn)商生產(chǎn)的設(shè)備提供一個(gè)國際公認(rèn)的比較標(biāo)準(zhǔn)）， MOELCUBES 的 PET 具有以下優(yōu)勢【3】 ：
（1） 單床 FOV 可做整只大/小鼠的全身掃描成像；
（2） 極佳的空間分辨率： 在徑向上均勻一致的亞毫米級(jí)別（0.9mm） ；
（3） 極佳的峰值靈敏度： 12.4% (255-765 keV)；
（4） 極佳的能量分辨率： 12%；
（5） 在 散射 分?jǐn)?shù) （ scatter fraction ） 、 對(duì)比 恢復(fù)系 數(shù)（ contrast recoverycoefficient， CRC） 、溢出比率（spill-over ratio， SOR） 等指標(biāo)上也優(yōu)于同類產(chǎn)品。



圖 11. PET 單床 FOV 可做整只小鼠的全身成像， 高通量成像可同時(shí)做 4 只小鼠。



圖 12. PET 單床 FOV 和 SPECT 多床 FOV 可做整只大鼠的全身成像。



圖 13.高分辨率 PET，可觀察到細(xì)微結(jié)構(gòu)，如斑馬魚的脊柱、小鼠肺泡上的腫瘤、小鼠的紋狀體和心臟的乳頭狀肌結(jié)構(gòu)【2】 。



圖 14.因?yàn)橛懈叻直媛屎透哽`敏度， PET 可以極低放射劑量成像。

MOLECUBES 的 CT 也具有低放射劑量和快速成像功能，同時(shí)保證極佳的分辨率。



圖 15.在噪聲調(diào)整技術(shù)下的極低放射劑量和快速 CT 成像：僅需 2.8mGy 和 25s【2】 。

軟件設(shè)計(jì)友好，用戶使用界面簡單直觀， 整個(gè)軟件操作在 10 步以內(nèi)，任何研究人員在半天的培訓(xùn)后都可以進(jìn)行儀器操作成像。

5.2 PET/CT 應(yīng)用舉例



圖 16.藥物代謝研究： 20min 動(dòng)態(tài) PET/CT 圖像，藥物對(duì)肝臟有毒性，不能殘留在肝臟里，動(dòng)態(tài)成像最后肝臟不亮，說明沒有藥物殘留【2】 。

（六） 附錄
更 多資訊， 請聯(lián)系： 森西 賽智科技 有限公司 ，電 話： 010-61666616，郵 箱：info@sinsitech.com，網(wǎng)址： www.sinsitech.com。

參考文獻(xiàn)：
【1】 Sellmyer,M.A.,et.al., Imaging CAR T Cell Trafficking with eDHFR as a PETReporter Gene, Molecular Therapy, Vol28, No.1, January 2020.
【2】 Molecubes website: www.molecubes.com
【3】 NEMA paper: Performance evaluation of the MOLECUBES β -CUBE——a high spatial resolution and high sensitivity small animal PET scanner utilizing monolithic LYSO scintillation detectors, Physics in Medicine & Biology. 63(2018) 155013(12pp).