Mettl3在協調癌癥的生長和轉移的分子機制的應用

2021年3月2日，云序客戶空軍軍醫(yī)大學張瑞以及楊安鋼共同通訊在Nature Communications 上在線發(fā)表題為”RNA m6A methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming”的研究論文，該研究運用云序生物m6A-meRIP-seq的方法發(fā)現骨髓細胞中Mettl3的敲除可促進體內腫瘤的生長和轉移，并闡明了該過程的分子機理。該結果為尋找腫瘤免疫治療靶點提供了一個新的方向。
 
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：12.121
研究方法：m6A- meRIP-seq、meRIP-qPCR等
文章鏈接：RNA m6A methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming


研究內容
（1）骨髓特異性的Mettl3缺失促進腫瘤生長和轉移。
為了研究m6A修飾在巨噬細胞中的作用，作者將WT BMDMs(骨髓源性巨噬細胞)與B16細胞共孵育，發(fā)現Mettl3的表達明顯減少。為了研究骨髓細胞中的Mettl3是否能夠調節(jié)腫瘤的進程。作者將Mettl3fl/fl小鼠與Lyz-cre小鼠雜交敲除了髓腔室中的Mettl3。然后，對Mettl3fl/flLyz2+/+ (WT)和Mettl3fl/flLyz2cre/+ (KO)小鼠的BMDMs和腹腔巨噬細胞(PMs)進行qRT-PCR和western blotting檢測。結果表明，來自KO小鼠的BMDMs和BM中Mettl3 mRNA表達分別下降了約75%和80%。此外，KO BMDMs中mRNA上m6A修飾水平低于WT。作者將B16或LLC細胞皮下注射到WT或KO小鼠中，KO小鼠的腫瘤生長速度明顯快于WT小鼠，這些敲除Mettl3小鼠的生存時間縮短(圖1a-d)。通過尾靜脈將B16或LLC細胞注射到小鼠體內，生物發(fā)光成像顯示，與WT小鼠相比，KO小鼠的肺轉移增強(圖1e, f)。組織學檢查顯示，與WT小鼠相比，KO小鼠有更大、更多的肺轉移結節(jié)且Ki67染色增加(圖1g-j)，導致KO小鼠比WT小鼠總生存時間縮短(圖1k)。此外，與正常組織中的巨噬細胞相比，TAMs中Mettl3的表達減弱（圖1 l)。上述結果說明Mettl3在骨髓細胞中的缺失會導致腫瘤的生長和增殖。

為了探討B(tài)MDMs中Mettl3的缺失是否會促進腫瘤生長，作者建立了巨噬細胞和腫瘤細胞的混合模型。用CFSE標記BMDMs，并將B16或LLC細胞共注入小鼠皮下F4/80免疫熒光染色結果顯示CFSE標記的細胞共注射BMDMs可在腫瘤中存活2周。進一步的分析表明，B16或LLC細胞與KO BMDMs共注射可加速腫瘤的生長(圖2a-f)。接下來，在實驗前兩天通過靜脈注射氯膦酸脂質體來減少小鼠的巨噬細胞，然后將B16細胞靜脈注射到小鼠體內，生物發(fā)光成像顯示，巨噬細胞耗竭消除了WT和KO小鼠腫瘤生長和轉移的差異(圖2g, h)，并通過肺腫瘤組織學分析證實了這一點(圖2i, j)。消耗了巨噬細胞的小鼠的生存期得到延長，用氯膦酸脂質體處理的WT和KO小鼠之間沒有明顯差異(圖2k)。綜上所述，巨噬細胞中METTL3在促進腫瘤進展中發(fā)揮重要作用。

（2）巨噬細胞中Mettl3的缺失通過增強M1-和M2-like TAM和Treg對腫瘤的浸潤來重塑腫瘤微環(huán)境。
為了評估Mettl3對免疫微環(huán)境的影響，采用流式細胞術對脾和肺進行免疫表型分型，發(fā)現KO小鼠的M1巨噬細胞， M2巨噬細胞和調節(jié)性T細胞的總體百分比增加。為了進一步研究Mettl3對腫瘤微環(huán)境的影響，通過單細胞RNA測序分析了WT或KO小鼠腫瘤中的CD45+細胞。KO小鼠的腫瘤與WT小鼠的腫瘤在免疫細胞的組成上存在差異，包括TAMs、MDSCs和CD4+的數量增加，T細胞以及粒細胞和CD8+ T細胞數量減少的趨勢。此外，通過流式細胞術對含有mettl3-缺陷巨噬細胞的腫瘤組織進行免疫表型分析，發(fā)現M1-和M2-like TAMs總體百分比增加(圖3a)。此外，MDSCs和調節(jié)性T細胞的數量有增加的趨勢(圖3b-d)。先前的研究表明，Treg在各種腫瘤組織中的遷移和浸潤似乎依賴于腫瘤細胞或浸潤巨噬細胞產生的CCR4配體(CCL22)的表達。通過qRT-PCR和ELISA檢測發(fā)現，在mettl3缺失的BMDMs和TAMs中，CCL22表達明顯上調(圖3e, f)。作者研究了注射抗CD25抗體對Treg水平的影響，發(fā)現Treg水平有75%的下降。隨著Treg細胞數量的減少，Th1細胞和IFN-γ+ CD8 T細胞在腫瘤細胞中增加，而Th2細胞基本未受影響。進一步分析表明WT和接受抗CD25抗Treg消除抗體的KO小鼠在腫瘤生長或轉移方面沒有明顯差異，但與WT小鼠相比，在未處理組，KO小鼠的腫瘤生長增加(圖3g-k)。去掉Treg后，WT和KO小鼠的存活率差異也消失了(圖3l)。這些數據表明髓系細胞中Mettl3的缺失促進了腫瘤的生長和轉移，其方式依賴于M1/M2-like TAM浸潤和Treg募集。

（3）Mettl3敲除通過NF-kB / STAT3軸促進BMDMs中M1和M2極化。
為了研究Mettl3在巨噬細胞極化中的潛在作用，使用LPS和IFN-γ誘導M1巨噬細胞或IL-4誘導M2巨噬細胞。qRT-PCR檢測了M1和M2巨噬細胞相關基因的表達，發(fā)現在mettl3缺失的BMDMs中TNF-α、IL-6和Arg1的表達明顯上調(圖4a)。ELISA還發(fā)現Mettl3缺失的BMDMs中TNF-α和IL-6表達上調，IL-10表達相對不變(圖4 b)。在Mettl3缺失的BMDMs中也觀察到精氨酸酶活性的增加(圖4c)。在BMDMs中評估了p65，觀察到p65和STAT3磷酸化水平在mettl3缺失的巨噬細胞中升高(圖4d)。NF-κB的抑制降低了TNF-α、IL-6和Arg1，而抑制STAT3通路降低了WT和KO BMDMs中Arg1的表達(圖4 e)。芯片分析表明p-STAT3特異性結合到Arg1的啟動子上(圖4f)。接下來從攜帶腫瘤的小鼠中收獲并用流式細胞術檢測TAMs結果顯示，KO TAMs中M1和M2巨噬細胞相關基因表達同時增加，這與p65和STAT3磷酸化和ARG1表達增強有關(圖4g-i)。綜上所述，這些數據表明Mettl3的缺失導致NF-κB通路和STAT3信號通路的激活，從而導致M1和M2-like巨噬細胞極化。



（4）腫瘤細胞增強細胞因子的產生，并在mettl3敲降巨噬細胞中激活NF-κB和STAT3。

由于NF-κB和STAT3可受細胞外源性因子TNF-α或IL-6刺激BMDMs調節(jié)。免疫印跡結果顯示，KO BMDMs誘導p-p65和p-STAT3的能力比WT更明顯。qRT-PCR分析顯示TNF-α處理后TNF-α和IL-6的表達增加，通過bay11-7082阻斷NF-κB通路后逆轉，而IL-6作用后，Arg1的表達增加，通過STAT3抑制劑S3I-201處理后逆轉。這些結果提示，NF-κB/IL-6/STAT3信號軸在KO BMDMs中比WT BMDMs更活躍。
為了評估NF-κB/IL-6/STAT3信號軸在腫瘤微環(huán)境中的作用，將B16或LLC細胞與BMDMs孵育，發(fā)現IL-6在B16和LLC細胞中表達上調，p65磷酸化水平增加，并通過bay11 -7082阻斷NF-κB通路后逆轉(圖5a)。進一步發(fā)現TNF-α治療不僅增加了p65的磷酸化也增加IL-6的表達，用NF -κB抑制劑處理可逆轉腫瘤細胞中IL-6的表達(圖5b)。此外，WT或KO BMDMs用bay11 -7082或抗TNF-α抗體前處理然后與B16或LLC細胞共培養(yǎng)。qRT-PCR分析顯示，bbay11 -7082或抗TNF-α抗體的加入抑制了IL-6的表達(圖5c)，伴隨p65和STAT3磷酸化降低(圖5 d)。此外，在mettl3缺失的BMDMs與B16或LLC細胞共培養(yǎng)時，與WT BMDMs相比，Arg1的表達明顯降低(圖5e, f)�？傊�，這些數據表明，mettl3缺失的巨噬細胞通過調節(jié)細胞因子反應重塑了腫瘤微環(huán)境。

（5）METTL3的缺失會損害YTHDF1介導的SPRED2翻譯。
探討m6A在巨噬細胞重編程中的作用，對WT和KO BMDMs進行了m6A meRIP-seq，生信分析得到了m6A峰密度圖(圖6a)，Motif分析發(fā)現了m6A修飾的保守Motif“GGAC”(圖6b)。為確定m6a調控的巨噬細胞極化潛在的目標基因，作者在MAPK通路相關基因和70個m6A下調基因中取交集獲得候選基因。在這些基因中，Spred2上m6A水平明顯降低(圖6c, d)。此外，meRIP-qPCR 證實Spred2是m6A調控的靶基因(圖6e)。隨后在KO BMDMs和TAMs中發(fā)現，SPRED2蛋白表達降低，而mRNA水平沒有明顯改變(圖6f)。mRNA衰減實驗表明，m6A修飾對Spred2的衰減沒有明顯影響(圖6g)。因此推測在Mettl3缺失的BMDMs中，SPRED2蛋白表達的下調可能是由于YTHDF1控制的蛋白質翻譯效率的差異所致。
然后作者通過多聚體分析WT和KO BMDMs將RNA分成非翻譯部分，翻譯起始部分和翻譯活性多聚體(圖6h)。qRT-PCR結果顯示，mettl3缺失的BMDMs翻譯活性多聚體中Spred2 mRNA水平明顯低于WT BMDMs(圖6i)。然后檢測了METTL3是否被招募到Spred2啟動子中并影響Spred2的表達，結果表明野生型METTL3 和催化死亡突變體METTL3可影響熒光素酶活性。為了研究CDS中m6A甲基化是否能調控SPRED2的表達，將m6A修飾保守位點GGAC突變?yōu)镚CTC (SPRED2 -CDS mut1或SPRED2 -CDS mut2)或同時突變(SPRED2 -CDS mut1/2)。其中Spred2-CDS mut2和Spred2-CDS mut1/2降低了SPRED2水平而Spred2-CDS mut1沒有，這表明Spred2-CDS mut2中的m6A基序是表達調控的主要位點(圖6j, k)。此外，RNA-IP結果顯示，YTHDF1和Spred2在Mettl3 KO植株中互作下降。為了證實YTHDF1在m6a調控SPRED2表達中的作用，在BMDMs中下調了YTHDF1的表達。YTHDF1基因敲除明顯減弱SPRED2在BMDMs中的表達，增加了ERK, NF-κB和STAT3磷酸化。qRT-PCR分析顯示，YTHDF1敲除后Tnf-α、Il-6、Arg1和Ccl22的表達增加。此外，BMDMs中SPRED2的下調導致ERK、NF-κB和STAT3磷酸化上調，并伴有Tnf-α， Il-6, Arg1和Ccl22上調表達。總的來說，BMDMs中Mettl3的丟失導致BMDMs中ythdf1介導的SPRED2的翻譯和ERK, NF-κB和STAT3磷酸化。

（6）髓系細胞中Mettl3的缺失會損害PD-1阻斷治療B16黑色素瘤的療效。
為了評估靶向METTL3激活抗腫瘤反應的潛力，在B16腫瘤轉移模型中測試了抗PD-1治療。正如預期的那樣發(fā)現在KO小鼠中，B16腫瘤對抗pd -1治療的反應較低，這增加了腫瘤生長和肺轉移，縮短了生存時間(圖7a-f)。說明Mettl3缺乏的髓系細胞參與了B16腫瘤對抗PD-1治療產生耐藥性。

總結
這篇文章結合m6A meRIP-seq、 meRIP-qPCR等實驗手段探究了甲基轉移酶METTL3的髓樣特異性缺失對小鼠腫瘤的生長和轉移的影響，揭示了Mettl3確實可通過影響巨噬細胞重編程增強小鼠腫瘤模型中的腫瘤生長和轉移，并減弱PD-1阻斷療法。該研究表明巨噬細胞中的m6A甲基化酶是潛在的癌癥治療靶標，為靶向治療癌癥提供了新的思路。
 

云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-seq）
對m6A RNA甲基化，目前流行的檢測手段為m6A-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：

• m6A 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
• m6A  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
• m6A  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
• m6A  mRNA測序
• m6A  miRNA測序

02 檢測整體m6A RNA修飾水平
 LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
精準高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法
快速檢測m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
 m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗證
 meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
05機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。

云序生物服務優(yōu)勢
優(yōu)勢一：發(fā)表10分以上文章zui多的m6A RNA甲基化測序服務平臺。云序已累計支持客戶發(fā)表42篇高水平文章，合計影響因子300分+，是國內支持發(fā)文多、累計影響因子高的公司。
優(yōu)勢二：至今完成4000+例 m6A測序樣本，覆蓋醫(yī)口、農口等各類樣本。
優(yōu)勢三：檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優(yōu)勢四：提供m6A一站式服務：m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down。
優(yōu)勢五：率先研發(fā)超微量MeRIP測序，RNA量低至500ng起。
優(yōu)勢六：國內zui全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙�；�和2'-O-甲基化測序。