naica®微滴芯片數(shù)字PCR在水質(zhì)環(huán)境相關(guān)優(yōu)勢細菌進行絕對定量的應用

在現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖中，水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的水質(zhì)直接影響魚類的健康和生產(chǎn)。微生物在去除有機物和氮循環(huán)、有毒硫化氫(H₂S)的產(chǎn)生方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但是如果微生物對魚類致病或發(fā)揮益生菌特性，則會直接影響魚類的健康。
 

近日，法國Stilla公司和挪威SINTEF Ocean合作在《Journal of Microbiological Methods》雜志上發(fā)表了一篇名為“Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR”的文章，旨在對水產(chǎn)養(yǎng)殖的相關(guān)優(yōu)勢細菌進行檢測。
 

在本文中，作者主要分析了與鮭魚生產(chǎn)相關(guān)的三種不同的細菌：

第一種為魚類病原體，與魚類的潰瘍性疾病有關(guān)的Moritella viscosa，會引起腸性紅嘴病的Yersinia ruckeri以及與魚類的細菌性冷水病有關(guān)的Flavobacterium psychrophilum。

第二種為可以從海產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到消費者身上的人類病原體，Listeria monocytogenes。

第三種為通過破壞飼養(yǎng)環(huán)境威脅魚類健康的細菌。通常硫酸鹽還原細菌（SRB）在厭氧條件下通過將硫酸鹽（SO₄^2-）轉(zhuǎn)化為有毒的硫化氫（H₂S）來影響魚類健康。可通過以Desulfovibrio desulfuricans為參考菌株進行SRB檢測。
 

研究學者利用naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的單重和多重檢測方式對上述優(yōu)勢菌種進行絕對定量。結(jié)果表明Moritella viscosa， Yersinia ruckeri，F(xiàn)lavobacterium psychrophilum檢出限在20 fg左右，Listeria monocytogenes和Desulfovibrio desulfuricans DNA檢測含量可低至2 fg，同時它們都具有較高的線性動態(tài)范圍（圖1）。多重cdPCR檢測結(jié)果與在相應的單重分析中檢測到的目標基因濃度非常吻合（圖2，圖3）。此次試驗充分證明了naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)可以同時精確定量復雜水質(zhì)樣品中多種優(yōu)勢菌株。
 

▲圖1 ：naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)定量5種
 

優(yōu)勢菌種的線性回歸圖，分別給出相應的方程和回歸系數(shù)

▲圖2：對Yersinia ruckeri（A）Flavobacterium psychrophilum（B）
的單、雙重分析結(jié)果進行比較。
 

在MMC-DNA背景(1 ng/μl)中添加Yersinia ruckeri ，F(xiàn)lavobacterium psychrophilum gDNA，10倍稀釋后進行基因拷貝數(shù)定量。

▲圖3 ：在1 ng/μl MMC-DNA背景下，單重(圓形)和三重(三角形)測定的靶基因拷貝濃度繪制。

恒等線表示每個點的X坐標和y坐標相等的位置。

文章基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)完成對多種優(yōu)勢菌株的定量檢測。

naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司的naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)在進行核酸檢測時具有獨特的優(yōu)勢。該系統(tǒng)利用cutting-edge微流體創(chuàng)新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作為數(shù)字PCR過程的耗材。樣品通過毛細通道網(wǎng)格以30,000個微滴的形式進入2D芯片中。3色熒光檢測儀器，整個流程只需要兩個半小時，并可進行數(shù)據(jù)的質(zhì)控和結(jié)果追溯分析，獲得的數(shù)據(jù)真實可靠。
 

naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質(zhì)控，3小時內(nèi)即可獲得至少6個靶標基因的絕對拷貝數(shù)濃度。