利用多對(duì)引物/探針分析比較qRT-PCR和ddPCR兩種方法對(duì)SARS-COV-2檢測(cè)

利用多對(duì)引物/探針分析比較qRT-PCR和ddPCR兩種方法對(duì)SARS-COV-2檢測(cè)
Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets

發(fā)表期刊：Emerging Microbes & Infections 2020 影響因子：6.9
作者單位：a State Key Laboratory of Virology, Modern Virology Research Center, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China;
b State Key Laboratory of Virology, Renmin Hospital, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China;
c Department of Infectious Disease, Zhongnan Hospital, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China;
d Frontier Science Center for Immunologyand Metabolism, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China 通過使用不同的引物探針對(duì)比較qRT-PCR和ddPCR兩種檢測(cè)方法對(duì)SARS-COV-2的檢測(cè)情況。 SARS-CoV-2的大流行對(duì)臨床病原體診斷提出了迫切的要求。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）測(cè)定法是檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)，已被廣泛用于快速檢測(cè)SARS-CoV-2感染。但是，qRT-PCR結(jié)果不準(zhǔn)確的問題日益暴露，qRT-PCR的假陰性報(bào)告（FNR）不可避免的，這可能會(huì)影響及時(shí)診斷，早期治療，預(yù)防傳播和評(píng)估出院標(biāo)準(zhǔn)。液滴數(shù)字PCR（ddPCR）用于SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的補(bǔ)充使用可以最大程度地減少FNR。
研究人群和樣本采集

本研究中，我們使用健康人和SARS-CoV-2感染患者的鼻咽拭子cDNA，在相同條件嚴(yán)格比較了8種常用的引物/探針組的qRT-PCR和ddPCR的性能。 圖1A為RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，在健康人樣本為陰性對(duì)照，其中引物對(duì)UCDC-N1、UCDC-N2、CCDC-N  CT值<40表明有非特異性擴(kuò)增這樣易導(dǎo)致10−4和10−3稀釋的低病毒載量的樣本檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假陽性， 相反，在沒有非特異擴(kuò)增的引物探針對(duì)中， UCDC-N3，HKU-，Charité-E和HKU-ORF的檢測(cè)低載量的病毒樣本時(shí)，易出現(xiàn)假陰性。并且根據(jù)結(jié)果來看最靈敏的引物探針對(duì)CCDC-ORF在10−4稀釋時(shí)可以檢測(cè)到3/10（30％）陽性樣品。另外，引物探針對(duì)CCDC-ORF在病毒載量低時(shí)CT值范圍從35.5到39.4，一致性較差，在病毒載量較高時(shí)結(jié)果一致性較好表明qRT-PCR仍然是檢測(cè)正常病毒的可靠方法。

    圖B表示使用相同引物/探針組的ddPCR結(jié)果，表明ddPCR在低病毒載量樣本的檢測(cè)總體上有所改善。健康樣本對(duì)照中，盡管顯示UCDC-N1和N2有擴(kuò)增背景但它們?nèi)匀豢梢詤^(qū)分低病毒載量樣品（稀釋10−4）。此外，雖然UCDC-N3，HKU-N和CCDC-N顯示較低的非特異性擴(kuò)增背景，Charité-E，HKU-ORF和CCDC-ORF沒有任何非特異性擴(kuò)增，但是，所有低病毒載量的樣本都可以產(chǎn)生正確的陽性報(bào)告。因此，ddPCR可以在病毒載量較低時(shí)，可以顯著減少檢測(cè)中的FNR和FPR。
   
   

• 使用不同引物/探針組進(jìn)行qRT-PCR的結(jié)果。橫坐標(biāo)為稀釋倍數(shù)（轉(zhuǎn)換為log10），縱坐標(biāo)為Ct值， ND為陰性CT值≥40。
• 使用不同引物/探針組的ddPCR結(jié)果。橫坐標(biāo)為稀釋倍數(shù)（轉(zhuǎn)換為log10）縱坐標(biāo)為拷貝數(shù)。ND為陰性0拷貝。對(duì)于每個(gè)引物探針組，綠色陰影區(qū)域?yàn)榻】等说臉颖荆↖gM / IgG陰性），超出該閾值為陽性。

   

結(jié)果表明，與qRT-PCR相比，ddPCR方法可顯著減少不準(zhǔn)確的結(jié)果，包括FNR和 FPR。同時(shí)，由于qRT-PCR這種標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法易出現(xiàn)FNR或FPR，對(duì)于SARS-COV-2臨床檢測(cè)的更好選擇是核酸測(cè)試

結(jié)合成像，血清測(cè)試以及經(jīng)驗(yàn)豐富的臨床醫(yī)生的判斷，而不是僅僅依靠qRTPCR�？傊�，qRT-PCR適用于大規(guī)模診斷正常病毒載量樣本中病毒感染的檢測(cè)。但是，對(duì)靈敏度和精度有特殊要求的定量ddPCR將是更理想的方法 。

 文章下載地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmid/32448084/ 
 

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