高通量流式技術(shù)應(yīng)用紀(jì)要-Cell新冠免疫研究新進(jìn)展

2020年11月Cell上發(fā)表了一篇新冠病毒研究文章，題為《Compromised Humoral Functional Evolution Tracks with SARS-CoV-2 Mortality》，來(lái)自麻省總醫(yī)院（MGH）、麻省理工學(xué)院（MIT）和哈佛大學(xué)的Ragon研究所等研究人員，揭示了SARS-CoV-2死亡率相關(guān)的體液免疫應(yīng)答。
   
文章指出，對(duì)于新冠病毒的疫苗開(kāi)發(fā)，目前仍然缺乏明確的免疫相關(guān)性研究支持。在其他病原體感染中，中和作用能產(chǎn)生保護(hù)作用，但不清楚在更為廣泛的人群中，只靠中和作用是否足以對(duì)抗SARS-CoV-2產(chǎn)生保護(hù)作用。因此，為了充分定義保護(hù)性體液免疫，研究人員分析了193名中重度住院患者體液反應(yīng)的早期演變。
  
iQue
在本項(xiàng)研究中，研究人員采用iQue高通量流式細(xì)胞平臺(tái)，結(jié)合基于微球的蛋白定量方法，對(duì)大批量的患者血漿樣本中的免疫球蛋白（IgG1、IgG3、IgM、IgA1和IgA2）進(jìn)行快速高通量檢測(cè)和定量分析。
 
下面小編就帶大家看看這項(xiàng)研究是如何進(jìn)行的。
  193名住院患者分為三組，在感染出現(xiàn)癥狀后1個(gè)月內(nèi)采樣1-8次，共計(jì)392份血漿樣本（如圖A所示）：

• 中度感染后痊愈的住院病人，共82例，采集血漿樣本累計(jì)122份
• 重度感染后痊愈的住院病人，共76例，采集血漿樣本累計(jì)196份
• 重度感染死亡的住院病人，共35例，采集血漿樣本累計(jì)74份

 
對(duì)這193名SARS-CoV-2感染患者的392份血漿樣本進(jìn)行5種免疫球蛋白定量分析。在該檢測(cè)中采用的是基于微球的蛋白定量法，結(jié)合iQue高通量流式細(xì)胞技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速、高通量檢測(cè)和自動(dòng)定量分析。具體來(lái)說(shuō)，首先將感興趣的目的抗原（S蛋白）與熒光標(biāo)記的微球進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，然后將偶聯(lián)抗原的微球進(jìn)行清洗和阻斷，之后加入適當(dāng)稀釋的病人血漿樣本，孵育一定時(shí)間后清洗，最后加入另一種熒光標(biāo)記的檢測(cè)抗體，最后用iQue 高通量流式細(xì)胞儀采集血漿樣本，用Forecyte軟件分析數(shù)據(jù)獲得抗原特異性抗體的每個(gè)亞類(lèi)和同型（IgG1、IgG3、IgA1、IgA2和IgM）的滴度數(shù)據(jù)。
  檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)（如圖B所示）：

• 癥狀出現(xiàn)1周內(nèi)，三組患者均觀察到類(lèi)似的SARS-CoV-2抗原特異性IgM和IgA滴度，嚴(yán)重疾病幸存者的特異性IgA1滴度略高。同樣，IgG3滴度也未觀察到明顯的組間差異。然而，抗S特異性IgG1滴度在中度和重癥患者間有顯著差異，而且重癥死亡病人的IgG1滴度更低。
• 到第2周時(shí)，與中度疾病患者和死亡患者相比，在重癥患者中觀察到幾乎所有S蛋白特異性抗體同型和亞類(lèi)的滴度顯著升高，所有抗原的滴度也顯著升高。在死亡患者和中度疾病的患者中，S特異性IgG1滴度增高較慢。
• 到第3周，所有組的IgA和IgM水平幾乎相當(dāng)。然而，與死亡組相比，患有中重度疾病的幸存?zhèn)�體在第三周都產(chǎn)生了更高的IgG亞類(lèi)滴度，這表明在幸存者中IgG免疫力發(fā)展是一致的，而在非幸存者中則是延遲和受損的。

 
因此，盡管非幸存者在早期都產(chǎn)生了有力的IgG抗體和IgM抗體，但其IgG發(fā)展存在潛在的選擇性缺陷，與COVID-19死亡率相關(guān)。
 
事實(shí)上，研究人員不僅分析了針對(duì)S蛋白的特異性抗體免疫反應(yīng)變化。作者在補(bǔ)充數(shù)據(jù)中還展示了這些患者血漿中針對(duì)RBD、N、S1 trimer、S1、S2蛋白的特異性抗體各種亞型（IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgM）在出現(xiàn)癥狀后1周、2周和3周以上的動(dòng)態(tài)發(fā)展變化。
  小編初略一算，392份樣本，6種目的蛋白，5種抗體亞型，每個(gè)樣本要獲得30個(gè)讀數(shù)，共計(jì)11,760個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，這么高的通量，無(wú)怪乎研究人員選擇iQue——在最快的時(shí)間內(nèi)，從少量的珍貴樣本中獲得盡可能多的信息，加快新冠研究進(jìn)程！
 
隨后，考慮到IgG類(lèi)別轉(zhuǎn)化的差異，研究人員還檢測(cè)了這種受損的類(lèi)別轉(zhuǎn)化帶來(lái)的功能性結(jié)果，如SARS-CoV-2特異性抗體與低親和力IgG-Fcɣ受體（FcɣRs）和IgA-Fc -α受體（FcαR）結(jié)合的能力（結(jié)果如圖C所示），這對(duì)引起抗體效應(yīng)功能至關(guān)重要，以及抗體介導(dǎo)的固有免疫效應(yīng)功能，如抗體依賴(lài)的細(xì)胞吞噬（ADCP）、抗體依賴(lài)的中性粒細(xì)胞吞噬（ADNP）和抗體依賴(lài)的補(bǔ)體沉積（ADCD）效應(yīng)（結(jié)果如圖D所示）。所有流式檢測(cè)均在iQue高通量流式細(xì)胞儀上完成。
 
為了進(jìn)一步研究在SARS-CoV-2感染后重癥存活或未存活的個(gè)體之間，特異性抗體特性或抗原特異性是否存在差異，研究人員基于上述所有分析指標(biāo)（抗體滴度、與不同IgG受體結(jié)合水平，及抗體介導(dǎo)的各種固有免疫效應(yīng)）生成了極坐標(biāo)圖（polar plot）來(lái)分析癥狀出現(xiàn)后1、2和3周體液免疫特征的潛在模式。
  如上圖所示，早在出現(xiàn)癥狀后的第一周，重癥存活患者中即觀察到體液免疫增強(qiáng)。雖然兩組患者的反應(yīng)總體上都有所增強(qiáng)，但存活患者的反應(yīng)比未存活患者的上升更為一致和強(qiáng)勁。雖然兩組的IgA、IgM反應(yīng)類(lèi)似，但總體而言，未存活患者組的IgG3水平、FcR結(jié)合和Fc功能呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)。這在癥狀出現(xiàn)后第二周后可觀察到，在第三周這種趨勢(shì)進(jìn)一步放大，與之前單變量分析中觀察的結(jié)果類(lèi)似。尤其是，幸存者表現(xiàn)出整體較高的吞噬反應(yīng)。為了闡明不同組間體液免疫應(yīng)答的總體差異，每類(lèi)特性單變量差異的非參數(shù)組合揭示，與死亡患者相比，重癥幸存患者的FcR結(jié)合水平早在癥狀出現(xiàn)后一周總體顯著增高，F(xiàn)c功能性反應(yīng)在第3周增高。這些數(shù)據(jù)突出了與COVID-19死亡率相關(guān)的體液免疫反應(yīng)缺陷。
 
 
欲了解更多詳情，請(qǐng)點(diǎn)擊文獻(xiàn)原文《Compromised Humoral Functional Evolution Tracks with SARS-CoV-2 Mortality》，小編的分享就到這里啦！