Countstar雙熒光AO/PI細胞計數(shù)法在含紅細胞全血樣本計數(shù)中的優(yōu)勢

從全血中提取細胞樣本是一個常用的實驗技術手段，因為這類樣本能模擬人體或動物的真實細胞環(huán)境。相對于下游的實驗例如藥物篩選、功能研究等會比單純的細胞系會有更好的實驗效果。

從血液中提取細胞最重要的一步就是去除紅細胞。以成年人外周血為例，其各種細胞的數(shù)量及比例如下
表所示:
 

	紅細胞	白細胞			血小板
含量 （個/L）	（4.0-5.5）×1012	（4.0-10.0）×109			（1.0-3.0）×1011
		中性粒細胞	淋巴細胞	單核細胞
占比		50%-70%	20%-40%	3%-8%

 
紅細胞數(shù)量巨多，為了下游實驗能制備好的細胞樣本必須去除紅細胞。目前常用去除紅細胞有以下幾個方法：
1.氯化銨裂解法：
它既不損傷有核細胞又能充分的去除紅細胞。這種方法簡單易行且比較溫和的紅細胞去除方法，主要用于經(jīng)酶消化分散的組織細胞的分離純化，淋巴細胞的分離純化以及組織細胞蛋白與核酸提取等實驗中紅細胞的去除。經(jīng)紅細胞裂解液裂解得到的組織細胞中不含紅細胞，可進一步用于原代培養(yǎng)、細胞融合、流式細胞分析、核酸與蛋白的分離和提取等。
但是裂解后紅細胞碎片較多，不易去除。
2.低滲裂解法
利用細胞滲透作用原理，細胞在低濃度緩沖液中會滲透吸水導致紅細胞破裂，而白細胞相對紅細胞有一定的耐受壓，可以達到分離的目的。但是低滲法也能對白細胞有一定損傷，會對后續(xù)功能實驗有影響。
3.密度梯度離心
常用的兩種介質是Ficoll和PercollTM 。Ficoll是蔗糖的多聚體，常用于外周血單個核細胞的分離。Percoll是二氧化硅膠體顆粒，可形成連續(xù)和不連續(xù)兩種梯度，主要能分離細胞，亞細胞結構和病毒的分離。密度梯度離心分離能更好的去除雜細胞獲取目的細胞，且不會損傷細胞在下游分析中的功能或性能；常用于分選及功能實驗；該方法效果好但是耗費時間長。

全血樣本經(jīng)細胞提取后用于下游實驗時，精確的細胞計數(shù)是細胞實驗中至關重要的一步。因此需要對總的有核細胞和活細胞都要進行計數(shù)。雖然臺盼藍染色法是常用的活細胞計數(shù)方法，但是對于含有紅細胞、血小板和雜質的樣本，臺盼藍染色法不能區(qū)分計數(shù)有核細胞、紅細胞和雜質。如果想快速精確計數(shù)有核細胞且進行精確細胞活力分析，那么Countstar雙熒光AO/PI細胞計數(shù)法必不可少，它能保證計數(shù)結果的準確性和重復性。

 

 
Countstar細胞分析儀還能對全血樣本直接計數(shù)分析。實驗過程如下：
1）取 20µL 血液樣品并用 180µL PBS 稀釋。
2）取 12µL AO/PI 染色液加入 12µL 樣品中，用移液器輕輕混合;
3）將 20µL 混合溶液吸入細胞計數(shù)板;
4）讓細胞在計數(shù)板內靜置約 1 分鐘;
5）將計數(shù)板放入 Countstar ® FL 儀器;
6）選擇“AO/PI 活率”測定，然后輸入此樣品的樣品 ID。
7）選擇稀釋比率和細胞類型，點擊“運行”開始測試。
結果
1.全血的明場圖像
在全血的明場視野圖像中，有核細胞淹沒在紅細胞中不可見。圖1

 
2.全血的熒光圖像
AO 和 PI 染料都能對細胞核中的 DNA 染色。因此，血小板、紅細胞或細胞碎片的存在不會影響白細胞濃度和活率結果�；罴毎�（綠色）和死細胞（紅色）很容易在熒光圖像中看到（圖 2）。

 

3.白細胞的濃度和活率
Countstar® Rigel 軟件自動對每個樣品的三個視野進行細胞計數(shù)，并計算白細胞總數(shù)（1202）、濃度（1.83x106細胞/ ml）和活率（82.04％）的平均值。 全血圖像和數(shù)據(jù)以PDF、圖片或Excel 格式導出進行其他分析或數(shù)據(jù)歸檔。

 

在不裂紅時對全血進行有核細胞計數(shù)可計算有核細胞的回收率。采用熒光計數(shù)法對分離后的樣本能有效排除細胞碎片、紅細胞等雜質影響，從而達到精確計數(shù)目的。