DREADDs技術(shù)對(duì)GPC信號(hào)通路的影響

　　如何在體內(nèi)環(huán)境條件下研究復(fù)雜多樣的 G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路？這是擺在科研人員面前的一大難題，“只能由設(shè)計(jì)藥物激活的設(shè)計(jì)受體”——DREADDs 技術(shù)的出現(xiàn)解決了這個(gè)難題。并且，DREADDs 的出現(xiàn)改變了基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化神經(jīng)科學(xué)的研究。

 

　　化學(xué)遺傳學(xué) （Chemogenetics） 是指一種蛋白被改造與先前未被識(shí)別的小分子化合物相互作用的過(guò)程。多種蛋白的改造已被報(bào)道，包括激酶、非激酶的酶類、G 蛋白偶聯(lián)受體  （GPCRs） 和配體門控離子通道�；瘜W(xué)遺傳學(xué)技術(shù) DREADDs （Designer receptors exclusively activated by designer drugs） 被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)中，并被稱為通過(guò) G 蛋白信號(hào)通路選擇性操作細(xì)胞活力的生物學(xué)“鎖和鑰匙” （Lock-and-key） 系統(tǒng)。

 

 

　　G 蛋白偶聯(lián)受體 （G-protein-coupled receptors, GPCRs） 是人類基因組中最大的蛋白質(zhì)超家族。GPCRs 是一大類七次跨膜的受體蛋白，通過(guò)與 G 蛋白偶聯(lián)，隨后調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，以響應(yīng)激素、神經(jīng)遞質(zhì)、離子、光、氣味、趨化因子和其他刺激 ，參與了眾多生理過(guò)程包括感光、嗅覺(jué)、行為和情緒的調(diào)節(jié)、自主神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等。GPCRs 在生理學(xué)和疾病中扮演著重要的角色，是非常有吸引力的藥物靶點(diǎn)。

 

　　經(jīng)典的 GPCR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于受體介導(dǎo)的異源三聚體 G 蛋白的激活。異源三聚體 G 蛋白由 Gα、Gβ 和 Gγ 三個(gè)亞基組成，其中 Gα 亞基可以與鳥(niǎo)苷二磷酸 （GDP） 結(jié)合，具有 GTP 水解酶活性。當(dāng) G 蛋白處于非活化態(tài)時(shí)，為異三聚體，Gα 亞基與 GDP 結(jié)合。經(jīng)典 GPCR 通路活化：

 

　　不同類型的 GPCRs 與細(xì)胞外各種配體 （胞外第一信使） 結(jié)合從而接受外界的信號(hào)刺激，然后 GPCRs 被活化。

 

　　→ → GPCRs 與 G 蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，G 蛋白 Gα 亞基構(gòu)象發(fā)生改變并排斥 GDP，轉(zhuǎn)而結(jié)合 GTP，G 蛋白活化。

 

　　→ → G 蛋白再激活其下游的各種效應(yīng)器，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的第二信使，如環(huán)磷酸腺苷 （cAMP）、環(huán)鳥(niǎo)苷酸 （cGMP）、肌醇三磷酸 （IP3）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 （PIP2）、Ca2+ 和 NO 等，從而將信號(hào)逐級(jí)傳遞下去，最終細(xì)胞響應(yīng)各類刺激產(chǎn)生不同的興奮性變化。

 

　　

 

　　圖 1. G 蛋白偶聯(lián)受體的模式圖[10]

 

　　非經(jīng)典的 GPCR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于小 G 蛋白 （Small G proteins） 的激活，小 G 蛋白通常是由大約 200 個(gè)氨基酸組成的單一多肽，同樣具有 GTP 水解酶活性。

 

　　GPCRs 廣泛分布于各個(gè)組織器官，其內(nèi)源性和外源性配體、細(xì)胞功的多樣性，以及 G 蛋白家族的復(fù)雜多樣，都使得體內(nèi)特定 GPCR 信號(hào)通路的探究之路困難重重。DREADDs 這時(shí)候就出場(chǎng)啦~

 

 

　　1991 年，Strader 等人首次嘗試改造 GPCRs，然后使用外源性的人工合成配體激活改造后的 GPCRs，激活特定的 GPCR 信號(hào)通路。可惜的是，他們使用的合成配體的效力太低，無(wú)法用于進(jìn)一步的體內(nèi)研究。

 

　　1998 年，Coward 等人創(chuàng)造了一種突變的 κ 阿片受體 （KOR），并命名為 Ro1 和 Ro2，Ro1 和 Ro2 對(duì)天然的阿片肽配體不敏感，但對(duì)合成的KOR激動(dòng)劑有反應(yīng)。此后，更多的 GPCRs 被改造，成功的應(yīng)用于特定的 GPCR 信號(hào)通路的體內(nèi)研究。被改造的 GPCRs 稱為 RASSLs，這一方法則被稱為 RASSLs 技術(shù)，可以作為簡(jiǎn)化 GPCR 信號(hào)通路復(fù)雜性的工具。不過(guò) RASSLs 技術(shù)仍然存在一些局限：

 

　　1. 其配體對(duì)天然受體具有明顯的親和力和效力 （非選擇性活性），限制了RASSLs在體內(nèi)的應(yīng)用；

 

　　2. 缺少體內(nèi)高效力配體；

 

　　3. 合成配體可能與其他蛋白靶點(diǎn)有親和力；

 

　　4. 許多 RASSLs 受體在體內(nèi)有高基礎(chǔ)信號(hào)，會(huì)掩蓋合成配體誘導(dǎo)的表型。

 

　　Pei Y 等人在 2008 年正式提出了使用 DREADDs 技術(shù)克服 RASSLs 技術(shù)的局限性。DREADDs 與 RASSLs 技術(shù)原理相同，兩者都是將不同的 GPCRs 進(jìn)行改造，使改造后 GPCRs 只接受外源性的人工合成配體的信號(hào)，并激活相應(yīng)的 GPCR 信號(hào)通路，從而引發(fā)細(xì)胞不同的變化。RASSLs 受體大多是單突變體，對(duì)于一些天然配體仍然有反應(yīng)，DREADDs 則對(duì)天然配體無(wú)反應(yīng)。

 

　　常見(jiàn)的 DREADDs 受體包括 hM3Dq 、hM4Di 和 GsD （引起 Gs 相關(guān)信號(hào)通路激活） 均是雙位點(diǎn)突變，對(duì)天然配體無(wú)反應(yīng)，這降低了體內(nèi)基礎(chǔ)信號(hào)產(chǎn)生的幾率。

 

　　PS：此前 Blaine N. Armbruster 等人鑒定出人毒蕈堿乙酰膽堿受體 （mAChR） 3 亞型的雙突變體 （Y149C3.33/A239G5.46），即 hM3Dq，以及 4 亞型的雙突變體  （Y149C3.33/A239G5.46），即 hM4Di。hM3Dq 和 hM4Di 對(duì)天然配體乙酰膽堿 （Ach） 無(wú)反應(yīng)，但是可以被小分子疊氮平-N-氧化物 （CNO） 激活。hM3Dq 被 CNO 激活時(shí)引起  Gαq 相關(guān)信號(hào)通路的激活，hM4Di 被 CNO 激活時(shí)能有效抑制 cAMP 的產(chǎn)生，激活 Gi 相關(guān)信號(hào)通路。

 

　　

 

　　圖 2. hM3Dq 和 hM4Di 受體結(jié)構(gòu)示意圖

 

　　CNO 與 DREADDs 受體的親和力也更高，可以作為高效配體在各類動(dòng)物體內(nèi)廣泛應(yīng)用。此外，CNO 具有類似藥物的特性，但在藥理學(xué)上是惰性的，缺乏明顯的脫靶作用，這也減少了合成配體與其他蛋白質(zhì)靶點(diǎn)結(jié)合的可能性。

 

 

　　目前，DREADDs 技術(shù)廣泛用于神經(jīng)元的相關(guān)研究，操作步驟可以概括如下：

 

　　1、選定并改造合適的 DREADDs 受體；

 

　　2、通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或病毒載體，將 DREADDs 受體基因?qū)�入�?dòng)物體內(nèi)。目前已開(kāi)發(fā)出攜帶 DREADDs 受體轉(zhuǎn)基因的重組腺相關(guān)病毒 （AAV） 載體，通過(guò)添加細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，配合立體定位注射的方法，實(shí)現(xiàn) DREADD 受體基因在不同組織細(xì)胞內(nèi)的精準(zhǔn)表達(dá)。如果使用 Cre-Lox P 的條件性基因敲除動(dòng)物可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)基因的條件可控性表達(dá)；

 

　　3、對(duì)動(dòng)物進(jìn)行 CNO 給藥 （控制時(shí)間或劑量）；

 

　　4、DREADDs 受體的有效性的檢測(cè)和動(dòng)物表型檢測(cè)。

 

　　盡管 DREADDs 技術(shù)早已成為研究動(dòng)物神經(jīng)元調(diào)節(jié)的強(qiáng)有力工具，但由于 CNO 具有較差的腦外顯率，并且通過(guò)代謝降解會(huì)產(chǎn)生抗精神病藥物氯氮平 （Clozapine），這些特性限制了 DREADDs 技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)上應(yīng)用。隨著新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，將  DREADDs 技術(shù)和正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像技術(shù) （PET） 結(jié)合，使 DREADDs 技術(shù)在更為廣泛的平臺(tái)使用成為現(xiàn)實(shí)。

 

　　2019 年，美國(guó)國(guó)立藥物濫用研究所 Jordi Bonaventura 等人的一項(xiàng)研究首次將 PET 技術(shù)與 DREADDs 技術(shù)相結(jié)合。研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出了 3 種新型的 DREADDs 配體 JHU37152、JHU37160 和 [18F]JHU37107。這幾種配體都是 DREADDs 受體的強(qiáng)激動(dòng)劑，具有出色的大腦滲透能力，并且不會(huì)轉(zhuǎn)化為氯氮平，其中，[18F]JHU37107 放射化學(xué)結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定，可以用作特異性的 PET 放射性示蹤劑，在小鼠、大鼠和恒河猴體內(nèi)對(duì)局部定位的神經(jīng)元及其遠(yuǎn)程投射成功地進(jìn)行了 DREADDs 檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)性神經(jīng)元投射標(biāo)測(cè)。DREADDs 技術(shù)和 PET 成像技術(shù)結(jié)合的關(guān)鍵在于開(kāi)發(fā)新型高效的且有穩(wěn)定放射化學(xué)結(jié)構(gòu)的 DREADDs 配體。

 

　　

 

　　圖 3. PET 放射性配體 [18F]JHU37107 在局部靶向 DREADDs 作用[11]

 

　　a. [18F]JHU37107 的結(jié)構(gòu)；b. [18F]JHU37107 與轉(zhuǎn)基因 D1-DREADD 小鼠大腦中的 DREADDs 結(jié)合；c. [18F]JHU37107 與大鼠皮層中表達(dá)的 AAV-DREADDs 結(jié)合；d. [18F]JHU37107 與猴子杏仁核中表達(dá)的 hM4Di 結(jié)合。

 

　　總結(jié)：

 

　　GPCRs 參與復(fù)雜多樣的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，是目前最有潛力的藥物靶點(diǎn)之一。然而，GPCRs 的復(fù)雜性和多樣性給這些受體的研究帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。DREADDs 技術(shù)的出現(xiàn)為人工控制 GPCR 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和揭示特定生理事件背后的機(jī)制提供了強(qiáng)有力的工具。近年，DREADDs 技術(shù)與 PET 技術(shù)的結(jié)合更是擴(kuò)大了該技術(shù)的適用范圍。相信未來(lái) DREADDs 技術(shù)還會(huì)在更多領(lǐng)域發(fā)揮作用。

 

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　　Cyclic AMP

 

　　細(xì)胞內(nèi)的第二信使，由于某些激素或其它分子信號(hào)刺激激活腺苷酸環(huán)化酶。

 

 

　　DREADDs 受體的配體，可以激活 DREADD 受體 hM3Dq 和 hM4Di。

 

　　Clozapine

 

　　毒蕈堿乙酰膽堿受體 M1 受體的拮抗劑和 M4 受體的激動(dòng)劑，可用于抗精神分裂癥的研究。

 

　　Acetylcholine chloride

 

　　一種神經(jīng)遞質(zhì)，通過(guò)刺激煙堿乙酰膽堿受體，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活性。

 

 

　　收錄了 1400+ 種靶向 GPCRs 的小分子化合物，可以用于 GPCR 相關(guān)的不同研究及藥物開(kāi)發(fā)篩選。

 

　　神經(jīng)信號(hào)化合物庫(kù)

 

　　收錄了 1400+ 種神經(jīng)信號(hào)相關(guān)的小分子化合物，可以用于研究神經(jīng)調(diào)控及神經(jīng)疾病。

 

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