MIQE中核酸質(zhì)量控制環(huán)節(jié)的操作簡(jiǎn)易說(shuō)明

RNA樣本：

比較不同的樣本時(shí)，應(yīng)保證各樣本中含有大致相同量的RNA，因此需要對(duì)所提取的RNA進(jìn)行定量。常用的定量方法包括：分光光度法、熒光染料檢測(cè)、瓊脂糖凝膠電泳、毛細(xì)管凝膠電泳和3'：5'分析。

由于不同的方法產(chǎn)生不同的結(jié)果，因此直接比較不同方法的測(cè)定結(jié)果是很不科學(xué)的。建議使用熒光RNA結(jié)合染料(如RiboGreen)定量RNA，此法在檢測(cè)低濃度目標(biāo)時(shí)表現(xiàn)出最佳性能。任何情況下都建議僅使用單一方法測(cè)定所有樣本并報(bào)告相關(guān)信息。檢測(cè)和報(bào)告全基因組DNA的污染程度，并記錄能夠耐受的這些污染的臨界值標(biāo)準(zhǔn)也是非常重要的。另外還應(yīng)重點(diǎn)報(bào)告RNA樣品是否已經(jīng)過(guò)RNA酶處理(包括酶的類型及反應(yīng)條件)，并報(bào)告每個(gè)核酸目標(biāo)在陽(yáng)性質(zhì)控品和無(wú)反轉(zhuǎn)錄質(zhì)控品存在下Cq值的比較結(jié)果。

此外，還需對(duì)RNA模板進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。除非提取的總RNA量太低以至于不允許進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。但產(chǎn)生這種特殊情況是有條件的：從單細(xì)胞、血漿、其他無(wú)細(xì)胞體液、一些激光捕獲樣品或澄清組織培養(yǎng)基中提取RNA，或提取操作和RT-qPCR測(cè)定通過(guò)一個(gè)連續(xù)的、單管實(shí)驗(yàn)完成。還需要注意的關(guān)鍵信息包括RNA的數(shù)量、完整度、不存在反轉(zhuǎn)錄或PCR抑制劑。值得注意的是RNA在體內(nèi)的降解非常明顯，這是mRNA為應(yīng)對(duì)環(huán)境刺激而進(jìn)行的自然調(diào)節(jié)。研究人員尚不能控制RNA的降解，其表現(xiàn)之一是即使高質(zhì)量的RNA樣品也顯示出不同的mRNA降解差異。

A260/A280的吸收度比值必須在中性pH的緩沖鹽條件下測(cè)定，但如果進(jìn)行核酸定量分析，特別是測(cè)定細(xì)胞mRNA濃度微小(<10倍)的差異時(shí)，單單提供以上測(cè)量信息是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。還要提供RNA純度的信息，因?yàn)镈NA或酚的存在會(huì)改變此比值。另外，至少應(yīng)該提供凝膠電泳的證據(jù)，如果可以最好提供rRNA的微流控分析結(jié)果或參考基因或靶基因的3'：5'的完整度檢測(cè)結(jié)果。使用Bioanalyzer或Experion系統(tǒng)計(jì)算RNA完整度或RNA質(zhì)量指標(biāo)數(shù)值的優(yōu)勢(shì)在于，這種測(cè)定提供了RNA樣品總體狀況的定量信息。但需要注意的是這些數(shù)值只是與rRNA的質(zhì)量有關(guān)，而不是測(cè)定質(zhì)量的絕對(duì)值。3'：5'分析方法要求兩種測(cè)定的PCR效率幾乎相同，而且受抑制的程度不能有差異。此法對(duì)于足以產(chǎn)生可靠結(jié)果的RNA質(zhì)量的閾值標(biāo)準(zhǔn)的界定也是有必要的。理想情況下，測(cè)定方法應(yīng)該以一組“完整性參考基因”為目標(biāo)，可能沒(méi)有內(nèi)含子，3'：5'的閾值比約為0.2-5，顯然，我們需要進(jìn)一步的研究以建立一個(gè)普遍適用的、符合成本效益的、簡(jiǎn)單的程序來(lái)評(píng)價(jià)RNA的完整度。

建議使用稀釋的樣本或常用的抑制方法如SPUD法檢查反轉(zhuǎn)錄活性或PCR的抑制作用。如果RNA樣本發(fā)生部分降解，這個(gè)信息一定要報(bào)道，這是至關(guān)重要的，因?yàn)檫@樣可能會(huì)使方法檢測(cè)低濃度轉(zhuǎn)錄水平的靈敏度降低，而且由于降解引起的轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)差異可能會(huì)產(chǎn)生不正確的目標(biāo)比值結(jié)果。

DNA樣本：

一般情況下，DNA不會(huì)產(chǎn)生很大的降解問(wèn)題。然而，在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，DNA降解程度的評(píng)估是一項(xiàng)很重要的工作，例如在犯罪現(xiàn)場(chǎng)惡劣的環(huán)境條件下或大規(guī)模災(zāi)害或涉及多個(gè)失蹤人員的案件中，DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)可能已經(jīng)發(fā)生降解。PCR分析的小規(guī)模擴(kuò)增有助于最大限度地減少檢測(cè)有關(guān)的問(wèn)題，但目前已開發(fā)的方法主要用于DNA質(zhì)量的定量測(cè)定，我們應(yīng)該考慮將這些方法用于上述的特定目的抑制劑的存在會(huì)給測(cè)定結(jié)果帶來(lái)變異，因此文章中必須說(shuō)明是否存在抑制劑，以確保不影響DNA的測(cè)定結(jié)果，如病原體檢測(cè)和相應(yīng)的定量。在樣本中加入陽(yáng)性質(zhì)控品的方法可用于檢測(cè)抑制作用，但不同PCR反應(yīng)可能會(huì)受到不同程度的抑制，這些抑制劑往往是在核酸提取物中與DNA共純化的物質(zhì)。因此，常規(guī)實(shí)驗(yàn)中最好將核酸樣本稀釋，以證明觀察到的Cq或拷貝數(shù)的減少與預(yù)期結(jié)果是一致的，并報(bào)告這些數(shù)據(jù)。(資料來(lái)源：2020版MIQE指南)

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