閃式快速色譜方法的在HPLC中應(yīng)用

​摘要

Teledyne ISCO 分析色譜柱在ACCQPrep®  HPLC 系統(tǒng)通過一次簡單的偵查運(yùn)行即可生成分離方法。該流程不僅能匹配RediSep® HPLC色譜柱，也匹配RediSep Gold®金標(biāo)快速色譜柱，這意味著用戶可以同時(shí)開發(fā)閃式快速色譜的方法。來自其他供應(yīng)商的C18色譜柱也可以用于方法開發(fā)，但與RediSep色譜柱相比，選擇性可能稍微存在差異，這意味著出峰時(shí)間可能不一定會(huì)在預(yù)期的時(shí)間被洗脫。在本應(yīng)用報(bào)告中描述的方法放大流程是有效的，只需將時(shí)間轉(zhuǎn)換成柱體積，因?yàn)橐粋�(gè)化合物在某個(gè)特定溶劑組份的洗脫時(shí)間是特定的。另一種方法是使用ACCQPrep HP150使用RediSep Prep色譜柱和內(nèi)置在系統(tǒng)中的聚焦梯度發(fā)生器，從偵測運(yùn)行中快速創(chuàng)建聚焦梯度(參考應(yīng)用報(bào)告AN119)。

 

實(shí)驗(yàn)儀器和色譜柱

分析HPLC系統(tǒng)和表1中列出的色譜柱。

如果需要溶劑改良劑，同樣的改良劑需同時(shí)應(yīng)用于高效液相色譜儀和閃式快速制備系統(tǒng)，揮發(fā)性改進(jìn)劑在純化后更容易從樣品中去除。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

對(duì)于閃式快速色譜，首選洗脫時(shí)間約6個(gè)柱體積(CV)，當(dāng)轉(zhuǎn)換為CV單位時(shí)，很容易將uHPLC梯度從一個(gè)色譜柱放大到另一個(gè)色譜柱。

三段線性梯度效果很好，第一段為12 個(gè)CV，目標(biāo)化合物洗脫在中間，約6個(gè) CV，不管怎樣，起始和結(jié)束溶劑組成是洗脫化合物所需要的。由于HPLC系統(tǒng)駐留死體積的原因，沒有必要在運(yùn)行開始時(shí)等度保持，相對(duì)于柱體積和HPLC駐留死體積的大小，運(yùn)行CombiFlash®NextGen梯度時(shí)，目標(biāo)化合物可能提前或稍微滯后被洗脫。添加一個(gè)0.01分鐘時(shí)長的步驟，然后以100% B清洗色譜柱中清除殘留化合物。

每段長度(以分鐘為單位)的計(jì)算方法是用梯度長度乘以柱體積，然后除以流速。梯度表是通過將分段長度加到前幾次的總和而得到的。在表2中，柱體積中的片段長度被轉(zhuǎn)換為時(shí)間，并將添加的片段長度形成梯度表。

如果方法的分離度可以接受，使用相同的梯度表很容易創(chuàng)建一個(gè)閃式快速的梯度，用于以CV為單位的CombiFlash儀器。

結(jié)果

下面顯示的運(yùn)行使用了表2中列出的梯度片段。一次運(yùn)行使用2 × 50mm C8色譜柱，另一次使用4.6 × 150mm C18色譜柱。Benzophenone在水/乙腈體系的梯度洗脫。

C8, 2x50 mm 運(yùn)行實(shí)例

在RediSep Prep C8 2 x 50 mm色譜柱上開發(fā)的方法，3分鐘內(nèi)，梯度為40% - 50% B，然后一步升到100% B，使用水/乙腈體系清除色譜柱中的雜質(zhì)。

化合物洗脫時(shí)間為2min或7.9 CV。然后樣品在50 g RediSep Rf Gold C8柱(PN 69-2203-712)上運(yùn)行，使用相同的梯度，和已確定的柱體積。

閃式快速色譜柱的洗脫與uHPLC柱的洗脫非常接近，表明該方法可以通過這種方式轉(zhuǎn)移。

C18, 4.6 x 150 mm 運(yùn)行實(shí)例

在4.6 × 510mm RediSep Prep C18色譜柱上建立了的方法

使用水/乙腈體系，在18分鐘內(nèi)，梯度為50% - 60% B，然后一步升到100% B，以從色譜柱中清洗污染物。C18比C8具有更強(qiáng)的保留能力，因此在柱體積相同的保留時(shí)間下，需要更強(qiáng)的溶劑體系才能得到洗脫。

該化合物在11.9min或7.9 CV洗脫。將方法轉(zhuǎn)移到50 g RediSep Rf Gold C18色譜柱(PN 69-2203-336)上運(yùn)行，水/乙腈體系中。

再一次表明，閃式快速色譜柱與分析用高效液相色譜保留有很好的一致性。

值得注意的是，從uHPLC色譜柱轉(zhuǎn)換的方法在閃式快速色譜柱洗脫比預(yù)測保留時(shí)間稍早，而HPLC預(yù)測的洗脫時(shí)間比實(shí)際閃式快速色譜柱洗脫時(shí)間稍早。這是因?yàn)樵谟?jì)算中沒有考慮系統(tǒng)駐留死體積。

uHPLC和HPLC色譜柱在同一分析儀器上運(yùn)行，分析系統(tǒng)駐留死體積相對(duì)于uHPLC柱更大，但相對(duì)于4.6 mm色譜柱較小，因此不同運(yùn)行時(shí)間梯度延遲的程度不同。在分析過程中，最好使目標(biāo)化合物的洗脫在梯度的中間，以允許不同儀器之間保留體積一定的變化。 

 

結(jié)論

RediSep Prep色譜柱可以可靠地用于開發(fā)閃式快速色譜的方法，2 × 50mm uHPLC色譜柱是非常快速的方法開發(fā)手段，運(yùn)行基本在5分鐘內(nèi)完成。兩種色譜柱都需要極少量的樣品，節(jié)省幾乎所有的待純化樣品。
 

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ACCQ Prep HP150 高壓制備型HPLC色譜系統(tǒng)

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