Octet應(yīng)用紀(jì)要：檢測同源二聚體的污染物的方案

Octet
雙特異性抗體（BsAbs）是同時(shí)可以結(jié)合兩個(gè)靶點(diǎn)的抗體藥物，可以將效應(yīng)細(xì)胞直接作用于靶向腫瘤細(xì)胞，提高抗體的選擇性，改善藥物的安全性和有效性。與兩種單抗混合治療相比，雙特異性抗體可以降低開發(fā)和臨床成本，是當(dāng)下抗體藥物開發(fā)的香饃饃。預(yù)測2025年雙特異性抗體全球市場規(guī)模將達(dá)到80億美元【1】。美國FDA在2021年5月底頒布了最終版的《雙特異性抗體研發(fā)指導(dǎo)原則》【2】。

下面是此文的CMC quality consideration(生產(chǎn)工藝質(zhì)量屬性研究)部分：

親和力（affinity）大家都很熟悉了，以前關(guān)于生物藥物活性的一些指導(dǎo)原則中經(jīng)常出現(xiàn)。這次雙抗指導(dǎo)原則中的on-rate和off-rate是啥東東呢？“打開/關(guān)閉速率”？

當(dāng)然不是，這兩個(gè)詞的正確描述是（雙特異性抗體與兩個(gè)抗原間的）“結(jié)合速率”與“解離速率”。

關(guān)于檢測on-rate和off-rate

兩個(gè)分子（A和B）的結(jié)合實(shí)際上是動(dòng)態(tài)可逆的過程。A和B結(jié)合的同時(shí)，解離也同時(shí)發(fā)生，所以通常用結(jié)合速率與解離速率來表征其相互作用的速率，亦稱為動(dòng)力學(xué)表征。

動(dòng)力學(xué)表征參數(shù)包括：

· On-rate：結(jié)合速率常數(shù), 用kon或者Ka表示。
該參數(shù)代表配體（A）和分析物（B）之間的結(jié)合速率。每1M的A分子和B分子每秒產(chǎn)生的復(fù)合物數(shù)量，單位為 M-1s-1。

· Off-rate：解離速率常數(shù), 用koff或者Kd表示。
該參數(shù)反映了復(fù)合物（AB）每秒鐘發(fā)生解離的量的百分比。koff越大，解離越快，單位為s-1。

· KD：平衡解離常數(shù)，用KD表示。
KD代表了兩個(gè)分子相互作用結(jié)合能力的強(qiáng)弱，也就是我們通常所說的親和力（affinity），其數(shù)值等于Koff/Kon。


BLI技術(shù)是列入美國藥典
中的檢測動(dòng)力學(xué)方法之一

應(yīng)用基于BLI技術(shù)的Octet分子互作分析系統(tǒng)，能夠非標(biāo)記、實(shí)時(shí)地檢測兩個(gè)或多個(gè)分子間的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。常規(guī)方法如下：先將A分子（配體）固化在傳感器上，然后通過和B分子（分析物）的相互結(jié)合\解離這兩個(gè)步驟來獲取這些參數(shù)。

第一個(gè)步驟是結(jié)合，即將固化了A分子的傳感器浸入到含有B分子的溶液中進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，通過特異性結(jié)合生成AB復(fù)合物。
第二步是將含有AB復(fù)合物的傳感器浸入到不含B分子的緩沖溶液中進(jìn)行解離。分析軟件將根據(jù)實(shí)時(shí)的結(jié)合/解離曲線分析得到kon和koff值。

親和力（KD）的數(shù)值通常用ELISA這些傳統(tǒng)技術(shù)也能獲得。而動(dòng)力學(xué)參數(shù)Kon和Koff就只能通過以BLI技術(shù)為代表的實(shí)時(shí)非標(biāo)記檢測技術(shù)來進(jìn)行檢測。目前BLI技術(shù)已經(jīng)被美國藥典列為動(dòng)力學(xué)表征的互作方法之一，詳見15年的等待！BLI技術(shù)正式列入《美國藥典》（USP-NF）。


on-rate和off-rate的重要性

為什么這次發(fā)布的指導(dǎo)原則提出需要提供on-rate和off-rate這兩個(gè)重要的參數(shù)呢？這個(gè)就要從BLI技術(shù)和傳統(tǒng)的ELISA等方法的差別說起。

· ELISA是終點(diǎn)法（End Point）檢測，無法獲得解離\結(jié)合速率快慢的過程信息，而這些信息往往比單一的親和力值（KD）更重要；

· BLI技術(shù)在偶聯(lián)配體時(shí)，可以避免疏水包被導(dǎo)致的抗原表位喪失；

· BLI技術(shù)可以很好的檢測nM~pM范圍內(nèi)的親和力，而且重復(fù)性好；

· 整個(gè)檢測過程無需洗滌步驟，特別適合檢測解離較快的弱結(jié)合。

· Octet自動(dòng)化，節(jié)約大量人工成本，比如Octet RED384和HTX還可以整合機(jī)械臂。

在雜交瘤上清中用Octet的傳感器固化不同抗體，對(duì)同一濃度的抗原進(jìn)行結(jié)合解離的曲線，綜合考慮On-rate和off-rate對(duì)抗體進(jìn)行評(píng)估


Octet檢測雙特異抗體案例分享

目前已經(jīng)有很多篇文章或者專利用Octet檢測雙抗的親和力，這里陳老濕就引用NIH（美國國立衛(wèi)生研究院）的一篇文章以供大家學(xué)習(xí)【3】。該作者設(shè)計(jì)了一些HIV的中和抗體，其中一種名為VRC07 X 10E8的雙特異抗體可以同時(shí)識(shí)別CD4和gp41的MPER（近膜結(jié)構(gòu)域）兩種抗原，其VRC07針對(duì)CD4，而10E8針對(duì)MPER。

用AHC（anti-human Fc）傳感器固化抗體，檢測CD4和MPER，發(fā)現(xiàn)雙特異抗體的親和力與母本的一致。

用SA或者AR2G固化CD4，然后依次結(jié)合雙特異抗體和MPER，發(fā)現(xiàn)雙特異抗體可以同時(shí)和兩個(gè)抗原結(jié)合。



另外，這次發(fā)布的雙抗開發(fā)指導(dǎo)原則的CMC quality consideration內(nèi)容中，還提到需要檢測同源二聚體的污染物，Octet對(duì)此有專門的應(yīng)用方案，文末有下載哈！

該指導(dǎo)原則強(qiáng)調(diào)了koff和kon動(dòng)力學(xué)檢測的重要性。簡而言之就是僅僅做親和力表征已經(jīng)不夠用啦，還要檢測on-rate和off-rate這兩個(gè)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。不僅對(duì)雙特異性抗體如此，其他抗體藥物也要檢測與靶點(diǎn)或者Fc受體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。由于傳統(tǒng)方法的各種局限性，基于動(dòng)力學(xué)的檢測方法也會(huì)被越來越多地用于法規(guī)要求中。


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-參考文獻(xiàn)-

[1]https://www.prnewswire.com/news-releases/global-bispecific-antibody-market-to-2025-drug-sales--clinical-pipeline-insights-with-an-8-billion-market-opportunity-300780848.html).

[2]Bispecific Antibody Development Programs Guidance for industry(FDA).

[3] Bispecific Antibodies Targeting Different Epitopes on the HIV-1 Envelope Exhibit Broad and Potent Neutralization. Journal of Virology. (2015). 89:24.