顯微鏡下的空間與時(shí)間：現(xiàn)代顯微鏡概念在微觀世界觀察的應(yīng)用
從古至今，人類一直在追尋更高更遠(yuǎn)的真相，從遠(yuǎn)洋航行到太空探索，人們不斷征服一個(gè)個(gè)宏偉的目標(biāo)，但是人們?nèi)庋鬯?jiàn)的宏觀世界不是世界的全部，還有人眼無(wú)法看清的微觀世界，它同樣也吸引著無(wú)數(shù)人去探索和追尋。
無(wú)論宏觀還是微觀事物，我們的觀測(cè)都是基于三維空間的屬性，即XYZ三維，而對(duì)事物形態(tài)變化的觀察則需要再引入一個(gè)衡量因素--時(shí)間T，因此對(duì)事物觀察的最完備方式一定是XYZT的同時(shí)記錄，即形態(tài)+時(shí)間的長(zhǎng)時(shí)間攝影，這也是顯微鏡的終極功能。
經(jīng)過(guò)三百多年的發(fā)展，現(xiàn)代顯微鏡提出分辨率、景深、視野等概念，并不斷提出解決方案，顯微鏡已經(jīng)初步滿足我們對(duì)微觀世界觀察的需求，幫助我們記錄下微觀世界的空間和時(shí)間。
微觀世界觀察最重要的是細(xì)節(jié)的分辨，分辨率的概念便由此誕生，分辨率是指人眼可以區(qū)分的兩個(gè)點(diǎn)之間的最小距離，只在XY維度有效，根據(jù)瑞利判據(jù)，Rayleigh Criterion，正常人能分辨的極限是明視距離25cm處0.2mm的兩個(gè)點(diǎn)，當(dāng)我們使用顯微鏡后，我們可以看清更小距離的兩個(gè)點(diǎn)，這便提升了我們觀察的分辨率。隨著現(xiàn)代研究的不斷深入，人們對(duì)分辨率的要求也在不斷提高，而科學(xué)家們也在不斷的提升顯微鏡的分辨率，如電子顯微鏡將分辨率提升至納米級(jí)別，實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒的觀察，超高顯微成像技術(shù)，將顯微鏡的分辨率從200納米提升到幾十納米，實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞細(xì)胞器的觀察。
分辨率的提升也帶來(lái)了新的問(wèn)題，即視野和景深的減小，當(dāng)用普通中央照明法（使光線均勻地透過(guò)標(biāo)本的明視照明法）時(shí)，顯微鏡的分辨距離為d=0.61λ/NA，可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍為400—700nm，取其平均波長(zhǎng)550nm，波長(zhǎng)是固定常量，因此，增大NA數(shù)值，即可得到更小的D值，也就是可以分辨的兩點(diǎn)之間的距離更小，可以讓人眼看清楚更小的物體。
NA值即數(shù)值孔徑，描述了透鏡收光錐角的大小，NA = n * sinα，即透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率（n）和孔徑角（2α）半數(shù)的正弦之乘積。n為物鏡與樣本之間介質(zhì)的光折射率，當(dāng)顯微鏡物方介質(zhì)為空氣時(shí)，折射率n = 1 , 采用折射率高于空氣的介質(zhì)，可以顯著提高NA值，水浸介質(zhì)是蒸餾水，折射率為1.33；油浸物鏡介質(zhì)是香柏油或其它透明油，其折射率一般在1.52左右，接近透鏡和載玻片的折射率，因此，油鏡的NA值高于空氣鏡。
孔徑角又稱“鏡口角”，是透鏡光軸上的物體點(diǎn)與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度，增大鏡口角，可以提高正弦值，其實(shí)際上限約為72度（正弦值為0.95），乘以香柏油折射率1.52，可以得出最大NA值為1.45左右，代入分辨率計(jì)算公式，可以得出常規(guī)顯微鏡極限XY平面分辨率為0.2um左右。
NA值還會(huì)直接影響顯微鏡的視野亮度（B）。由公式B∝N.A.2/ M2 我們可以推出，亮度隨數(shù)值孔徑（N.A.）的增大或者物鏡倍率（M）的降低而增加。
從理論上來(lái)說(shuō)，我們應(yīng)該追求盡可能高的NA值，以獲得更好的XY平面分辨率和視野亮度。然而凡事都有兩面性，XY平面分辨率的提升，會(huì)帶來(lái)Z軸景深和觀察視野的減小。
顯微鏡一般都是垂直向下取景的，通過(guò)視場(chǎng)直徑內(nèi)觀察到的物體表面凸起的位置與凹下的位置都能夠看的很清楚時(shí)，那么凸點(diǎn)與凹點(diǎn)之間的高度差就是景深了，對(duì)于顯微鏡來(lái)說(shuō)景深越大越好，景深越大在觀察高低不平整的物體表面時(shí)，能夠得到更好更立體的清晰度畫(huà)面，大景深有助于我們對(duì)微觀世界進(jìn)行垂直方向形態(tài)的觀察，也就是XYZ三維形態(tài)中的Z軸信息。
景深就是象平面上清晰的象所對(duì)應(yīng)物平面的前后空間的深度：dtot=(λ*n)/NA + n/(M∗NA) * e，dtot：景深，NA ：數(shù)值孔徑，M ：總放大率，λ：光波波長(zhǎng), （通常λ=0.55um），n: 試樣與物鏡之間介質(zhì)的折射率（空氣: n=1、油: n=1.52）根據(jù)這個(gè)公式，我們可以知道，Z軸景深與XY平面NA值成反比。
除了景深外，視野也受到NA值的影響，通過(guò)儀器固定注視一點(diǎn)時(shí)所能看見(jiàn)的空間范圍即視野，它的計(jì)算與物鏡的放大倍數(shù)直接相關(guān)，觀察所看到的實(shí)際視野直徑等于視場(chǎng)直徑除以物鏡的放大倍數(shù)，目鏡會(huì)表明對(duì)應(yīng)視場(chǎng)數(shù)，如10/18，即放大倍數(shù)10倍，視場(chǎng)直徑18mm，因此當(dāng)目鏡確定后，放大倍數(shù)越大則觀察的視野越小。
XY平面分辨率是對(duì)局部細(xì)節(jié)的解析，而視野則決定了我們對(duì)樣本的觀察范圍，視野必然是越大越好，但受限于當(dāng)前的技術(shù)，我們必須采用高倍物鏡，才可以得到良好的NA值，因此,視野和NA值有間接的負(fù)相關(guān)系。
當(dāng)我們需要觀察的樣本大于我們的視野時(shí)，每次觀察只能看到一個(gè)局部，為了解決這個(gè)問(wèn)題，拼圖技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生。通過(guò)在XY方向移動(dòng)樣本，連續(xù)拍下不同位置的圖像，最后拼接在一起，就可以得到一張全視野的圖像。
▲鏡下局部視野
▲拼接后全視野
▲手動(dòng)拼接
▲自動(dòng)拼接(圖源：Echo顯微鏡)
拼接分為手動(dòng)和自動(dòng)兩種，手動(dòng)拼圖成本低廉，但是對(duì)人員的操作水平，經(jīng)驗(yàn)要求很高，如上圖，操作人員稍有不慎，就會(huì)出現(xiàn)圖片接縫問(wèn)題，同時(shí)手動(dòng)拼圖速度慢，不適合大批量，高通量樣本處理，比如醫(yī)院病理科日均上百病理切片觀察，手動(dòng)拼圖方式無(wú)法滿足要求。
自動(dòng)拼圖的核心部件是全自動(dòng)載物臺(tái)，結(jié)合軟件，可自動(dòng)實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)，大范圍全視野拍攝，結(jié)合自動(dòng)Z軸對(duì)焦補(bǔ)償，即可得到全視野的清晰圖像。
Echo Revolution 全自動(dòng)熒光顯微鏡
Echo Revolution全自動(dòng)熒光顯微鏡，將XYZ三軸全部實(shí)現(xiàn)電動(dòng)化，從而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)完成多圖拼接的大視野高分辨率成像，而電動(dòng)化的Z軸可以幫助用戶實(shí)現(xiàn)自動(dòng)聚焦、自動(dòng)定焦和Z-Stacking 多層掃描大景深成像。Echo Revolution全自動(dòng)熒光顯微鏡還添加了延時(shí)攝影功能，可以幫助用戶實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間觀察和時(shí)間回溯，使用戶可以進(jìn)行更全面的觀察實(shí)驗(yàn)。
