實(shí)驗(yàn)室選擇CO2培養(yǎng)箱的最佳方法和技巧

 

CO₂ 培養(yǎng)箱的用途是通過(guò)控制恒溫加濕環(huán)境中的二氧化碳?xì)怏w濃度，以確保維持最佳的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境�，F(xiàn)代的 CO₂ 培養(yǎng)箱為污染防治、有效利用實(shí)驗(yàn)室空間甚至特定需求提供專(zhuān)業(yè)化的解決方案，例如支持低氧應(yīng)用。在本指引中，我們?yōu)槟�提供選擇最佳培養(yǎng)箱的方法和技巧，以滿(mǎn)足您的需求。

選擇合適的型號(hào)

在過(guò)去，選擇 CO₂ 培養(yǎng)箱被認(rèn)為是一種日常采購(gòu)行為，經(jīng)�；�于以前的使用經(jīng)驗(yàn)�，F(xiàn)在，由于出現(xiàn)了大量可選的規(guī)格和專(zhuān)業(yè)功能，值得考慮自身的需求，仔細(xì)分析并選擇合適的培養(yǎng)箱，本指南給予您幫助。

最常用的 CO₂-碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)依賴(lài)于 5-10%的CO₂ 濃度，可產(chǎn)生 7.2 至 7.4的 pH 值。
 
腔內(nèi)氣體控制

控制培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度、CO₂ 濃度以及濕度對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的健康和生長(zhǎng)非常關(guān)鍵。對(duì)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系而言，最佳生長(zhǎng)溫度為37°C，大約 95%的加濕環(huán)境可避免培養(yǎng)物干燥。培養(yǎng)基緩沖系統(tǒng)需要使用 CO₂ 調(diào)節(jié) pH值。

 

溫度: 盡管市場(chǎng)上仍有水套式培養(yǎng)箱，但最先進(jìn)的系統(tǒng)采用直熱式、氣套式或者兩者的組合。在直熱式培養(yǎng)箱中，通過(guò)直接放置在外表面上的電加熱元件加熱培養(yǎng)腔。在氣套式加熱系統(tǒng)中，熱空氣在培養(yǎng)腔外部和隔熱層之間的空隙中循環(huán)。兩種系統(tǒng)需要的維護(hù)都要少于水套式培養(yǎng)箱，這是因?yàn)闆](méi)有水套，就無(wú)需補(bǔ)充和清空水，因此重量更輕、更緊湊、占用的實(shí)驗(yàn)室空間更小。另外，培養(yǎng)腔表面不會(huì)有滲水風(fēng)險(xiǎn)，因此培養(yǎng)箱可以采用高溫消毒方式進(jìn)行自行滅菌。
 

Eppendorf 解決方案：采用 Eppendorf 六面直熱式技術(shù)，可從全部 6 個(gè)側(cè)面加熱培養(yǎng)腔，包括外門(mén)在內(nèi)。采用多個(gè)快速反饋傳感器和先進(jìn)的微處理器控制，可調(diào)節(jié) 4 個(gè)獨(dú)立的加熱回路，保證培養(yǎng)腔內(nèi)溫度均勻。加熱元件的特定布置能夠?qū)崿F(xiàn)培養(yǎng)腔空氣的自然溫和對(duì)流循環(huán)（圖 1）。這有助于避免培養(yǎng)箱內(nèi)出現(xiàn)“涼點(diǎn)”，從而產(chǎn)生優(yōu)異的溫度穩(wěn)定性（37°C 時(shí)為±0.1  °C）和均勻性（±0.3°C），還可以避免溫度波動(dòng)過(guò)大，否則會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。開(kāi)門(mén)后的快速恢復(fù)溫度不需要風(fēng)扇，從而減少傳統(tǒng)設(shè)備的污染風(fēng)險(xiǎn)和振動(dòng)源。

CO₂ 感應(yīng)器：與熱導(dǎo)（TC）感應(yīng)器相比，使用紅外（IR）感應(yīng)器測(cè)量 CO₂ 濃度不受溫度和濕度波動(dòng)影響。頻繁開(kāi)門(mén)會(huì)導(dǎo)致溫度和相對(duì)濕度產(chǎn)生波動(dòng)，這 也會(huì)影響熱導(dǎo)感應(yīng)器的準(zhǔn)確度�？赡軝z測(cè)不出瞬時(shí)CO₂ 的變化，IR 傳感器更不容易受開(kāi)門(mén)干擾的影響。有的甚至能夠承受高溫，可以用于培養(yǎng)箱高溫消毒 過(guò)程。
 
Eppendorf 解決方案：為了精密控制CO₂，Eppendorf CO₂ 培養(yǎng)箱采用雙通道紅外（IR）感應(yīng)器和先進(jìn)的微處理器控制，確保高度均勻的氣體濃度和開(kāi)門(mén)后的快速恢復(fù)。先進(jìn)的 CO₂ 感應(yīng)器技術(shù)確保長(zhǎng)期、無(wú)偏離和準(zhǔn)確測(cè)量 CO₂ 濃度。
 
濕度：在多數(shù)系統(tǒng)中，裝有無(wú)菌蒸餾水的濕度控制盤(pán)-通過(guò)被動(dòng)蒸發(fā)產(chǎn)生濕度，它們保持大約 95%的相對(duì)濕度水平。
 
Eppendorf 解決方案：CellXpert^® C170i 培養(yǎng)箱配備單個(gè)水盤(pán)，易于拆卸清空、清洗和裝水，沒(méi)有其它需要清洗的排水閥。

圖 1: Eppendorf  六面直熱式技術(shù)使培養(yǎng)腔氣體能夠溫和地對(duì)流循環(huán)，保持整個(gè)培養(yǎng)腔內(nèi)穩(wěn)定的溫度和 CO2 控制。

氧氣控制：大氣中含有大約 21%的氧氣，細(xì)胞的生理性含氧濃度通常為 1%至 13%。人們已發(fā)現(xiàn)氧氣濃度是影響干細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育等的關(guān)鍵環(huán)境因素^[4]。這就是為什么各新興領(lǐng)域的科學(xué)家，例如干細(xì)胞研究，逐漸明白控制氧氣、CO₂ 和溫度的價(jià)值所在。如今大多數(shù)培養(yǎng)箱可選配氧氣控制。通過(guò)向培養(yǎng)腔 內(nèi)提供氮?dú)�，控制培養(yǎng)箱中的氧氣水平。因?yàn)槟承?培養(yǎng)箱消耗大量昂貴的氮?dú)�，所以有的培養(yǎng)箱為了 控制腔內(nèi)的氧氣濃度會(huì)明顯增加耗氣成本。
 
Eppendorf 解決方案：CellXpert C170i 可選氧氣控制，用于產(chǎn)生低氧環(huán)境，該功能可工廠安裝或者直接在實(shí)驗(yàn)室升級(jí)。該氧氣感應(yīng)器精密測(cè)量 O₂ 濃度， 可用于培養(yǎng)箱高溫消毒過(guò)程。由于低氮?dú)庀�耗和開(kāi)門(mén)后快速恢復(fù)，CellXpert C170i 可為低氧應(yīng)用提供最佳環(huán)境，例如培養(yǎng)干細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。

污染控制
 

除了可靠的腔內(nèi)氣體控制和內(nèi)置自動(dòng)消毒裝置外， 培養(yǎng)箱的創(chuàng)新設(shè)計(jì)可以幫助細(xì)胞培養(yǎng)研究人員克服最大的挑戰(zhàn)——污染。
 
一項(xiàng)主要措施是安裝 HEPA（高效空氣過(guò)濾器），該過(guò)濾器用于生物安全柜中。這需要在腔內(nèi)添加許多復(fù)雜部件，包括風(fēng)扇和管道，將氣體吸入通過(guò)過(guò)濾器，并在培養(yǎng)腔中重新分布。雖然腔內(nèi)氣體已經(jīng)過(guò)濾，但仍有若干缺點(diǎn)。由于內(nèi)部結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，有更多位置隱藏污染物，包括接縫和邊角。由于無(wú)法處理操作中濺出的培養(yǎng)基，導(dǎo)致細(xì)菌滋生風(fēng)險(xiǎn)，從而需要浪費(fèi)更多時(shí)間拆卸這些裝置進(jìn)行清潔和消毒。加壓氣流還會(huì)干擾培養(yǎng)的細(xì)胞并加速培養(yǎng)基干燥。除此之外，更重要的是需要定期維護(hù)和購(gòu)買(mǎi)新過(guò)濾器。另外，過(guò)濾器會(huì)成為污染源，導(dǎo)致其帶來(lái)的缺點(diǎn)比優(yōu)勢(shì)更多。
 
另一項(xiàng)措施是增加培養(yǎng)腔的紫外線照射劑量，據(jù)稱(chēng) 能消除培養(yǎng)腔內(nèi)氣體和水中的微生物。通常在承液 盤(pán)上蓋上通風(fēng)罩板，將紫外線燈與細(xì)胞培養(yǎng)腔分開(kāi)。打開(kāi)內(nèi)門(mén)后，該燈自動(dòng)打開(kāi)一定時(shí)間，照向循環(huán)加 濕空氣和承液盤(pán)中的水。定向氣流需要在培養(yǎng)箱背 面加裝風(fēng)扇和管道。盡管人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用紫外線 可有效處理培養(yǎng)箱中的氣體和水^[1]，但也發(fā)現(xiàn)相對(duì) 濕度超過(guò) 70%時(shí)會(huì)對(duì)紫外線有效性產(chǎn)生不良影響^[2]。紫外線只能對(duì)其直接照射的表面進(jìn)行消毒。培養(yǎng)箱 內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此紫外線無(wú)法到達(dá)許多表面進(jìn)行 消毒。另外，必須定期更換紫外線燈，保持其有效 性。
 
與風(fēng)扇輔助的培養(yǎng)箱內(nèi)強(qiáng)制氣流相比，無(wú)風(fēng)扇培養(yǎng) 箱通過(guò)對(duì)流溫和地循環(huán)氣流。湍流的潛在風(fēng)險(xiǎn)—— 樣品干燥、振動(dòng)和污染物進(jìn)一步傳播得以全部消除。無(wú)風(fēng)扇培養(yǎng)腔的設(shè)計(jì)沒(méi)有復(fù)雜內(nèi)部結(jié)構(gòu)，不會(huì)隱藏 污染物。由于采用平面設(shè)計(jì)、無(wú)接縫和死角，污染 物極少有機(jī)會(huì)生長(zhǎng)而不被發(fā)現(xiàn)。
 
如果出現(xiàn)培養(yǎng)基濺出，可以立即清潔，因?yàn)橐子诓潦门囵B(yǎng)腔體的所有表面。最近發(fā)布的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范指導(dǎo)建議采用無(wú)風(fēng)扇輔助的培養(yǎng)箱，可有效降低培養(yǎng)箱內(nèi)的污染傳播^[3]。
 
Eppendorf 解決方案：培化繁為簡(jiǎn)的培養(yǎng)箱腔體設(shè)計(jì)。Eppendorf CO₂ 培養(yǎng)箱的無(wú)風(fēng)扇培養(yǎng)腔體設(shè)計(jì)， 采用一體成型不銹鋼材料制成，無(wú)接縫或死角（圖2）。Eppendorf  直熱技術(shù)取消了風(fēng)扇和復(fù)雜的內(nèi)部裝置。這種優(yōu)雅簡(jiǎn)約的設(shè)計(jì)策略是避免死角或氣道內(nèi)微生物滋生，從而特別容易清潔和消毒。可以現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和消除污染，所有表面區(qū)域都易于擦拭和消毒。層架系統(tǒng)和擱板可 2 分鐘內(nèi)拆卸完畢。

圖 2: 易于清潔的 Eppendorf 培養(yǎng)腔體，一體成型，采用圓角和平滑的無(wú)接縫表面設(shè)計(jì)，避免死角處產(chǎn)生污染，能夠快速和方便地維護(hù)清潔。

    圖 3: 堅(jiān)固的支架可疊放兩臺(tái)CellXpert CO2 培養(yǎng)箱，疊放支架可通過(guò)重型腳輪移動(dòng)。節(jié)省空間，可根據(jù)不同需求調(diào)整配置。

1.Busujima H., Mistry D. A Comparative Analysis of Ultraviolet Light Decontamination versus High Heat Sterilization in the Cell Culture CO2 Incubator with the Use of Copper-Enriched Stainless Steel Construction to Achieve Active Back¬ground Contamination Control™.American Biotechnology Laboratory; February 2007

2.Burgener J., Eli Lilly and Company, Indianapolis, Position Paper on the Use of Ultraviolet Lights in Biological Safety Cabinets 228 Applied Biosafety (2006), 11 (4), 228-230.

3.Geraghty RJ, Capes-Davis A, Davis JM, Downward J, Freshney RI, Knezevic I, Lovell-Badge R, Masters JRW, Meredith J, Stacey GN, Thraves P, Vias M. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research, British Journal of Cancer (2014), 1-26 | doi: 10.1038/bjc.2014.166.

4.Mohyeldin A., Garzon-Muvdi T., Quinones-Hinojosa A. Oxygen in Stem Cell Biology: A Critical Component of the Stem Cell Niche, Cell Stem Cell (2010) 7(2), 150-161.