qPCR性能分析的四大要素-效率、線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍、檢測(cè)限和精密度

MIQE指南中明確提出，進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)必須測(cè)定以下檢測(cè)性能特點(diǎn)：PCR的效率、線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍、LOD和精密度。

1、PCR的效率：

強(qiáng)大和精確的qPCR測(cè)定通常具有高效率。在報(bào)告目的基因相對(duì)于參照基因的mRNA濃度時(shí)，PCR效率是非常重要的。ΔΔCq方法是測(cè)定樣本和用來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化的單個(gè)參照基因之間濃度差異的最常見(jiàn)的方法之一。如果計(jì)算出目的基因與參照基因的Cq值的差異(ΔCq)，就可以將不同樣本的ΔCq值直接進(jìn)行比較。值得注意的是，兩個(gè)基因的比較，必須在相似的擴(kuò)增效率下進(jìn)行。然而最常見(jiàn)的方法不一定是最合適的，相反已經(jīng)開(kāi)發(fā)了更為普通的定量模型用于校正擴(kuò)增效率的差異^[1]和多個(gè)參照基因的使用^[2]。

PCR擴(kuò)增效率必須通過(guò)校準(zhǔn)曲線(xiàn)法建立，因?yàn)樾��?zhǔn)法簡(jiǎn)單、快速、重現(xiàn)好，保證了PCR的平均反應(yīng)效率、分析靈敏度和檢測(cè)方法的穩(wěn)健性。擴(kuò)增效率，要通過(guò)校準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性部分的斜率計(jì)算，具體計(jì)算公式為：PCR效率= 10^-1/slope-1，即以初始模板濃度的對(duì)數(shù)為X軸(自變量)，以Cq值為Y軸(因變量)作圖。理論上效率的最大值為1.00 (或100%)，此值表明每個(gè)循環(huán)周期的產(chǎn)物量加倍。理想情況下，所報(bào)道的平均PCR效率的CI (可信區(qū)間)或SE (誤差)值應(yīng)該通過(guò)兩次校準(zhǔn)曲線(xiàn)法得到。

發(fā)表文章時(shí)，除了要提交每個(gè)定量目標(biāo)的校準(zhǔn)曲線(xiàn)外，還要提供校準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率和在Y軸上的截距。PCR效率的差異會(huì)產(chǎn)生不同斜率的校準(zhǔn)曲線(xiàn)。隨著模板量的變化，目的基因和參照基因Cq值的差異并非固定不變，因此，按照固定Cq值計(jì)算得到的相對(duì)濃度是不準(zhǔn)確的，可能會(huì)產(chǎn)生誤導(dǎo)結(jié)果。

大于40的Cq值是可疑的，由于其效率較低，建議不要報(bào)道。然而這種隨意設(shè)定Cq臨界值的做法是不科學(xué)的，因?yàn)檫@些值可能很低(可消除有效的結(jié)果)也可能很高(能增加假陽(yáng)性結(jié)果)。

2、線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍：

PCR反應(yīng)的動(dòng)態(tài)范圍應(yīng)該呈線(xiàn)性，即最高或最低的定量拷貝數(shù)應(yīng)該通過(guò)平均校準(zhǔn)曲線(xiàn)法得到，提交的文章應(yīng)該包括線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍。校準(zhǔn)曲線(xiàn)的產(chǎn)生依賴(lài)于所使用的模板，動(dòng)態(tài)范圍應(yīng)跨越至少3個(gè)數(shù)量級(jí)，最好擴(kuò)大到5或6個(gè)1og₁₀濃度范圍。校準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性區(qū)間必須包括目標(biāo)核酸的定量范圍。由于定量下限的界定往往很混亂，因此應(yīng)該報(bào)告提交文章中所謂線(xiàn)性范圍內(nèi)最低濃度處的變異。另外還必須報(bào)告線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)( R2值)，并且最好提供整個(gè)線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的CI值。

3、檢測(cè)限：

檢測(cè)限定義為能夠檢測(cè)到95%的陽(yáng)性標(biāo)本的最低濃度。換言之，將濃度在LOD水平處的待測(cè)樣本進(jìn)行多次重復(fù)測(cè)定，測(cè)得無(wú)效結(jié)果的概率小于5%。低拷貝PCR的出現(xiàn)是隨機(jī)有限的，而且不可能發(fā)生單次PCR的LOD值小于3個(gè)拷貝數(shù)的情況。然而，如果進(jìn)行多次反應(yīng)，則可通過(guò)數(shù)字PCR獲得低濃度范圍的準(zhǔn)確定量。事實(shí)上，可將濃度校準(zhǔn)品進(jìn)行有限稀釋?zhuān)�并按照泊松分布�?jì)算PCR反應(yīng)的失敗率和成功率。

4、精密度：

引起qPCR變異的因素很多，包括影響退火和變性的溫度差異、取樣誤差導(dǎo)致的濃度變異和隨機(jī)誤差。qPCR的精密度主要受濃度影響，并隨拷貝數(shù)增加而降低。最好進(jìn)行多次重復(fù)測(cè)定，并將以SD誤差線(xiàn)形式表示的批內(nèi)變異(重復(fù)性)和校準(zhǔn)曲線(xiàn)的CI (可信區(qū)間)在圖中標(biāo)示出來(lái)。變異系數(shù)CV不能用來(lái)描述Cq，但可用來(lái)表示拷貝數(shù)與濃度的變異。技術(shù)引起的變異應(yīng)區(qū)別于生物學(xué)變異。生物學(xué)復(fù)制可直接導(dǎo)致組間或不同處理方法間qPCR結(jié)果的顯著性差異。對(duì)于診斷分析，還需要報(bào)告不同地點(diǎn)和不同操作者的批間精密度(重現(xiàn)性)。

資料來(lái)源：2020版MIQE指南

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參考文獻(xiàn)：

[1] Pfaffl M W . A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J]. Nucleic Acids Research, 2001, 29(9):e45.

[2] Hellemans J ,  Mortier G ,  Paepe A D , et al. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data[J]. Genome Biology, 2007, 8(2).