RAF、MEK 和 ERK在KRAS 突變型肺癌耐藥性測試中的應(yīng)用

 

全球每年大約有 160 萬人死于肺癌，肺癌是目前世界上死亡率最高的癌癥之一。

 
 

 

KRAS 是一種致癌基因，編碼 KRAS 蛋白 (一種 small GTPase 轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白)。KRAS 通過結(jié)合 GTP/GDP 控制其活躍狀態(tài)，進(jìn)而控制其信號傳遞和下游級聯(lián)反應(yīng)。致癌性 KRAS 突變會破壞 GTPase 活性，進(jìn)而使 KRAS 蛋白鎖定在活躍狀態(tài)下，從而使啟動和維持腫瘤發(fā)生的信號過度活躍。在此前的《“不可成藥靶點” KRAS：關(guān)門才是大吉”》一推文中，我們介紹了 KRAS 的工作機(jī)制以及直接靶向 KRAS 蛋白的 AMG 510, MRTX849 等抑制劑。相對于風(fēng)頭正盛的“直接靶向”，靶向下游的效應(yīng)因子仍占據(jù) KRAS 突變肺癌靶向治療的重要地位。

 

KRAS 突變肺癌中，針對關(guān)鍵效應(yīng)因子 (包括 MAPK 通路成分 RAF、MEK 和 ERK) 的策略，受其持續(xù)抑制的相關(guān)毒性和/或適應(yīng)性耐藥機(jī)制所阻礙。除了開發(fā)新的抑制劑和靶點之外，聯(lián)合治療成為了克服腫瘤適應(yīng)性耐藥的首要考慮之一。如何開發(fā)這種聯(lián)治療方案，紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心 Scott W. Lowe 教授的團(tuán)隊在題為 “A combinatorial strategy for treating KRAS-mutant lung cancer” 的文章給我們做了一次經(jīng)典的“示范”。

 
研究背景
 

靶向  KRAS 下游效應(yīng)因子常由于代償性或平行途徑的激活而受阻，如 KRAS 突變型肺癌對 MEK 抑制的抗性 (耐藥性) 是由受體酪氨酸激酶 (RTK) 信號的反饋激活引起的。該研究中，作者采用系統(tǒng)化的方法來確定 MEK 抑制劑的聯(lián)合治療目標(biāo)。

 

圖 1. 間質(zhì)樣 KRAS 突變型肺癌中的 MAPK 反饋機(jī)制^[2]

 

研究方法
 

主要細(xì)胞系：KRAS^G12C 突變型肺癌細(xì)胞 (H23 和 H2030 細(xì)胞系)。

動物模型：KRAS 突變患者來源異種移植小鼠 (A549, H2122 細(xì)胞系)，KRAS^G12D 基因工程小鼠模型 (GEMM)。

 

主要實驗方法：shRNA 文庫篩選，免疫印跡和 RAS-GTP 檢測，qRT-PCR，micro-CT 技術(shù)，免疫組織化學(xué)。

 

研究結(jié)果
 

■ shRNA 篩選鑒定 Trametinib 敏化劑 (Sensitizer)

 

通過針對 536 種人類激酶的隨機(jī) shRNA 文庫篩選，鑒定出 8 個目標(biāo) shRNA，通過 MEK 抑制劑 Trametinib (曲美替尼) 處理，排除 2 個，再通過細(xì)胞驗證，確定了 BRAF、CRAF、ERK2 和 FGFR1 為最佳候選基因，這些基因的抑制作用使 KRAS 突變的肺癌細(xì)胞對 MEK 抑制劑 Trametinib 敏感。

 

圖 2. 篩選影響 Trametinib 敏感性的基因
 
Trametinib 對 ERK 的反饋再激活有負(fù)面影響，但是 MAPK 通路的再激活還是會發(fā)生。抑制 ERK 能阻斷 Trametinib 處理后 ERK 信號的反彈，說明了 KRAS 突變腫瘤對 MAPK 信號通路的顯著依賴性。另外，用 Trametinib 處理的 KRAS 突變細(xì)胞也顯示 PI3K 和 JAK/STAT 途徑的代償性激活。
 

■ 抑制 FGFR1 可增強(qiáng) Trametinib 的作用

 

已有報道表明，多種受體酪氨酸激酶 (RTKs) 涉及 RAS 通路拮抗劑適應(yīng)性耐藥。實驗表明，FGFR1 shRNA 不能抑制 KRAS 突變型肺癌的增殖，但與 Trametinib 聯(lián)合使用時表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用。多重激酶抑制劑 Ponatinib (普納替尼) 對 FGFR1 過表達(dá)的肺癌有抑制作用，它與 Trametinib  協(xié)同抑制細(xì)胞增殖，其抑制作用與 p-FRS2 誘導(dǎo)的程度相關(guān)。這種協(xié)同作用歸功于 Ponatinib 影響 MAPK 和 PI3K 途徑再激活的綜合能力。

 

圖 4. Trametinib+Ponatinib 抑制 KRAS 突變肺細(xì)胞的增殖

 

另外，抑制 FGFR1 對 Trametinib  的協(xié)同作用還具有特異性，例如，與 FGFR1/FRS2有關(guān)，而非 FGFR2 或者 FGFR3；對于 KRAS 突變型非癌細(xì)胞效果顯著，而 KRAS 野生型肺癌細(xì)胞中效果不顯著；在胰腺癌細(xì)胞系中具有協(xié)同作用，而在大腸癌細(xì)胞中無效。重要的是，這種基因型和組織特異性與 Trametinib 單一處理時觸發(fā) FRS2 磷酸化的能力有關(guān)。

 

■ 抑制 MEK/FGFR1 誘導(dǎo) KRAS 突變的腫瘤消退

 
KRAS 突變型人源腫瘤異體移植 (PDX) 和 GEMM 小鼠模型中進(jìn)行驗證，兩種模型顯示結(jié)果相似，Trametinib+Ponatinib 處理明顯導(dǎo)致腫瘤消退。此外，他們還檢測了 Trametinib 在 KRAS 突變型腫瘤中誘導(dǎo) FGFR1 信號傳導(dǎo)的能力。
 

圖 5. FGFR1 shRNA/Ponatinib+Trametinib 的抗腫瘤作用

 

KRAS 突變的 PDX 模型顯示，Trametinib 處理后 FRS2, ERK 和 AKT 磷酸化同時增加，但這種作用被 Ponatinib 消除了。
 
總結(jié)：該研究是對解決靶向 KRAS 突變腫瘤耐藥性的探索，從耐藥性相關(guān)基因的篩選、細(xì)胞驗證到體內(nèi)小鼠實驗驗證，結(jié)合細(xì)胞信號通路，最終確定了 FGFR1 信號的反饋激活是 KRAS 突變型肺癌對 Trametinib 的適應(yīng)性耐藥的重要機(jī)制，為 Trametinib 與 FGFR1 抑制劑聯(lián)合用于治療 KRAS 突變型肺癌提供了有力的支持。也證明了靶向適應(yīng)性耐藥機(jī)制可以提高分子靶向療法的療效，并為開發(fā)治療 KRAS 突變型肺癌的合理策略提供了一條途徑。

 

原文鏈接：DOI: 10.1038/nature18600

 

繼抗乳腺癌化合物庫上線之后，MCE 又整理了抗肺癌相關(guān)化合物庫，現(xiàn)已上線！

 

相關(guān)產(chǎn)品

抗肺癌化合物庫 收錄了 600+ 具有明確或潛在抗肺癌活性的化合物，這些化合物靶向肺癌治療中的關(guān)鍵靶點及信號通路。MCE 抗肺癌化合物庫是篩選抗肺癌活性化合物及其他肺癌相關(guān)研究的重要工具。

Ponatinib 有效的，具有口服活性的多靶點激酶抑制劑，能抑制 Abl, PDGFRα, VEGFR2, FGFR1 和 Src。

Doxycycline 四環(huán)素抗生素，廣譜的金屬蛋白酶 (MMP) 抑制劑；能改變 Tet 蛋白的構(gòu)像,誘導(dǎo) shRNA 的表達(dá)。

CCK8 Cell Counting Kit-8，簡稱CCK-8試劑盒或CCK8試劑盒，是一種基于WST-8而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性檢測的快速、高靈敏度試劑盒。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)

 

縮寫：

PDX: Patient derived tumor xenograft

RTK: Receptor tyrosine kinase

MAPK: Mitogen-activated protein kinase
 

參考文獻(xiàn)

↓ 下滑查看更多文獻(xiàn) 

1. EusebioManchado, et al. A combinatorial strategy for treating KRAS-mutant lung cancer. Nature. 2016 Jun 30;534(7609):647-51.
2. Hidenori Kitai, et al. Epithelial-to-mesenchymal transition defines feedback activation of receptor tyrosine kinase signaling induced by MEK inhibition in KRAS mutant lung cancer. Cancer Discov. 2016 Jul; 6(7): 754–769.