DMD基因敲除小鼠助力杜氏肌營養(yǎng)不良癥的研究

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DMD基因簡介
DMD基因，負責(zé)編碼Dystrophin蛋白，中文名稱為肌營養(yǎng)不良蛋白或抗肌萎縮蛋白。DMD蛋白是肌膜穩(wěn)定所必需的，因為它提供了肌膜上肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合體(DAPC)和肌動蛋白細胞骨架之間的重要聯(lián)系。該蛋白起緩沖連接的作用，將肌肉細胞錨定在周圍的結(jié)構(gòu)上，DMD蛋白的缺乏會導(dǎo)致DAPC的分解和肌動蛋白與細胞外基質(zhì)之間相互作用的喪失，從而導(dǎo)致肌纖維容易受到機械損傷[1]。DMD基因位于人類的X號染色體上，基因全長約2.2Mb，共有89個外顯子，氨基酸數(shù)量為3685個。該基因的突變與杜氏肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）相關(guān)。
 

圖1. 肌營養(yǎng)不良蛋白作為內(nèi)部細胞骨架和細胞外基質(zhì)之間的重要紐帶[1]
 

表1. DMD的基本信息

備注：標有√的意為賽業(yè)紅鼠資源庫有該種保存狀態(tài)的小鼠

杜氏肌營養(yǎng)不良癥
杜氏肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一種嚴重的X染色體隱性遺傳疾病，該疾病是由DMD基因的突變引起的，這種突變會阻斷肌肉中DMD蛋白的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致肌肉萎縮并引發(fā)多種并發(fā)癥。貝克爾肌營養(yǎng)不良癥（Becker muscular dystrophy, BMD）和DMD一樣，是由DMD基因中的突變引起的，但由于突變位點的不同，仍能產(chǎn)生部分具備功能性的DMD蛋白，因此BMD患者癥狀相較于DMD患者要輕。
 

圖2. 健康骨骼肌橫截面染色（a-d）和來自DMD患者的骨骼肌橫截面染色（e-h）[2]

DMD主要發(fā)生于男性，全球平均每5000個男嬰就有一人患此疾病�；颊咴�2-3歲左右會出現(xiàn)運動困難等早期癥狀，大多數(shù)患者在10-12歲左右開始依賴輪椅，并在20歲左右需要輔助呼吸。在最佳護理下，大多數(shù)DMD患者在20至40歲之間死于心臟或呼吸衰竭[2]。

DMD相關(guān)動物模型
DMD這種疾病最廣泛使用的動物模型是30年前首次發(fā)現(xiàn)的肌營養(yǎng)不良蛋白缺陷mdx小鼠，它像DMD患者一樣，在抗肌萎縮蛋白基因本身上存在突變，從而導(dǎo)致全功能性的肌營養(yǎng)不良蛋白表達減少。小鼠體內(nèi)的Dmd mdx突變在23號外顯子上有一個終止密碼子，能夠產(chǎn)生截短蛋白，并具有DMD的肌病理學(xué)特征；但其肌病理狀態(tài)較人類病程中表現(xiàn)得更輕微，且可根據(jù)小鼠品系遺傳背景發(fā)生改變。
 

圖3. 小鼠模型中突變的位置[3]

圖4. mdx小鼠模型中的肌肉橫截面[3]

DMD的治療
目前DMD的整體治療思路主要分為以下兩個方面：恢復(fù)功能性肌營養(yǎng)不良蛋白表達和靶向DMD發(fā)病機制的途徑。通過基因添加、外顯子跳躍、終止密碼子讀取和基因組編輯等療法可以恢復(fù)部分功能性DMD蛋白的表達，從而減輕患者的肌纖維損傷及萎縮�；�因添加療法主要是使用AAV等病毒載體傳遞功能性DMD的cDNA拷貝到受影響的組織，從而讓組織重新表達DMD蛋白。外顯子跳躍使用小片段修飾的RNA或DNA，稱為反義寡核苷酸，它們與前mRNA肌營養(yǎng)不良蛋白轉(zhuǎn)錄物的目標外顯子中的特定序列結(jié)合。這種結(jié)合會導(dǎo)致目標外顯子的跳過，從而恢復(fù)閱讀框并能夠產(chǎn)生部分功能性肌營養(yǎng)不良蛋白，而不是非功能性肌營養(yǎng)不良蛋白。
 

圖5. DMD的基因治療[2]

DMD蛋白的喪失會觸發(fā)多種病理途徑，包括炎癥、鈣穩(wěn)態(tài)喪失、功能性缺血和肌肉再生受損。而除了旨在糾正導(dǎo)致功能性DMD表達減少的療法外，目前在臨床試驗中同樣在研究針對由DMD蛋白表達減少引起的繼發(fā)性病理的化合物來改善肌肉功能和質(zhì)量，主要包括抗炎化合物、抗氧化劑、血管擴張劑等。

小結(jié)
DMD突變作為杜氏肌營養(yǎng)不良癥的主要發(fā)病原因，盡管其主要病因為功能性DMD蛋白缺失，但其發(fā)病機制存在很強的異質(zhì)性，在不同患者體內(nèi)DMD基因存在多種突變。盡管目前的基因療法已取得初步成效，但一些困難和挑戰(zhàn)仍未解決。首先，尚不清楚這些微肌營養(yǎng)不良蛋白在人體中的功能，不同外顯子組合行程的DMD蛋白的生物學(xué)功能具有差異，例如BMD患者體內(nèi)產(chǎn)生的DMD蛋白具有部分功能活性，而一些突變個體產(chǎn)生的DMD蛋白可能含有更多外顯子，但其蛋白活性完全缺失，肌萎縮癥狀反而會加劇。其次，通過轉(zhuǎn)基因外援表達DMD蛋白也有局限性，轉(zhuǎn)基因表達的壽命是有限的，并且大批量生產(chǎn)病毒載體是十分耗時且成本昂貴的。外顯子跳躍方法是針對前 mRNA轉(zhuǎn)錄本，由于反義寡核苷酸、RNA轉(zhuǎn)錄物易降解，必須重復(fù)使用反義寡核苷酸處理。
 

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參考文獻：

[1] R.J. Fairclough, et al., Therapy for Duchenne muscular dystrophy: renewed optimism from genetic approaches, Nat Rev Genet, 14 (2013) 373-378.

[2] D. Duan, et al., Duchenne muscular dystrophy, Nat Rev Dis Primers, 7 (2021) 13.

[3] J.W. McGreevy, et al., Animal models of Duchenne muscular dystrophy: from basic mechanisms to gene therapy, Dis Model Mech, 8 (2015) 195-213.