BLT小課堂 | 蛋白歸一化在Western Blot中的應(yīng)用

蛋白歸一化在Western Blot中的應(yīng)用
 

在Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)中，歸一化是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理的關(guān)鍵步驟。WB實(shí)驗(yàn)常設(shè)計(jì)不同的內(nèi)部對(duì)照或檢查點(diǎn)，對(duì)樣本或者實(shí)驗(yàn)中的偏差進(jìn)行監(jiān)控、修正。在WB中的偏差通常來(lái)自蛋白樣本濃度不均、凝膠上樣不一致或轉(zhuǎn)膜不完全。這些不一致性可以通過(guò)凝膠和膜的可見(jiàn)光或熒光標(biāo)記法監(jiān)控，用泳道總蛋白或內(nèi)參蛋白（比如GAPDH、β-tubulin、β-actin或cyclophilin B）進(jìn)行歸一化校正, 來(lái)保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。接下來(lái)由我給大家介紹下兩者的不同。

內(nèi)參蛋白校正
使用內(nèi)參蛋白校正是目前比較成熟的一種手段。具體校正方法就是在各蛋白樣品中選一種表達(dá)量保持一致的蛋白作為內(nèi)參蛋白（一般是管家基因），將每個(gè)樣品目的蛋白含量與內(nèi)參蛋白含量相除，得到每個(gè)樣品目的蛋白的相對(duì)含量。再進(jìn)行樣品與樣品之間的比較。

例：當(dāng)前有三份蛋白樣品S1、S2、S3，選擇的內(nèi)參基因?yàn)镃ontrol，需要檢測(cè)目的蛋白Test在這三份樣品中的相對(duì)表達(dá)量。

經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育、清洗等一系列實(shí)驗(yàn)操作后，獲得一張蛋白印跡膜。用GelView 6000 Pro全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)或GelView 6000Plus智能圖像工作站進(jìn)行顯影成像，獲得的發(fā)光圖。如圖1所示：
 

圖1

BioAnaly分析軟件具有蛋白歸一化分析功能，可以直接輸出蛋白歸一化結(jié)果，不需要進(jìn)行額外的操作，方便快捷，如圖2所示：
 

圖2
 

最終得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示：

圖3

如果僅看三個(gè)樣品中目的蛋白的灰度值（如圖3中藍(lán)色數(shù)據(jù)條所示），會(huì)發(fā)現(xiàn)其發(fā)光強(qiáng)度基本一致。此時(shí)并不能判斷目的蛋白的含量一致，因?yàn)閮?nèi)參蛋白的灰度值相差較大（如圖3中橙色數(shù)據(jù)條所示），因此還需要通過(guò)內(nèi)參蛋白進(jìn)行校正，將內(nèi)參蛋白的灰度值歸一化，可得到三個(gè)樣品中目的蛋白的真實(shí)灰度值，該結(jié)果才能比較準(zhǔn)確地反映目的蛋白的含量。計(jì)算結(jié)果如圖4所示：
 

圖4

通過(guò)內(nèi)參蛋白校正后發(fā)現(xiàn)待測(cè)蛋白在三個(gè)樣品中的相對(duì)表達(dá)量呈梯度上升趨勢(shì)。

總蛋白校正
總蛋白校正是一種新興的實(shí)驗(yàn)策略。具體校正方法就是直接測(cè)量樣品中總蛋白的含量（通過(guò)非特異性蛋白染料對(duì)泳道中所有蛋白進(jìn)行染色測(cè)定），將每個(gè)樣品目的蛋白含量與總蛋白含量相除，得到每個(gè)樣品目的蛋白的相對(duì)含量。再進(jìn)行樣品與樣品之間的比較。

例：當(dāng)前有四份蛋白樣品S1、S2、S3、S4，需要檢測(cè)目的蛋白Test在這四份樣品中的相對(duì)表達(dá)量（本次實(shí)驗(yàn)中使用的非特異性熒光染料，可以對(duì)所有蛋白進(jìn)行染色；二抗為FITC熒光標(biāo)記）。

經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育、清洗等一系列實(shí)驗(yàn)操作后，獲得一張蛋白印跡膜。

用GelView 6000Plus智能圖像工作站的熒光模塊進(jìn)行熒光成像，結(jié)果如圖5所示，泳道內(nèi)所有蛋白均產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度可以代表樣品總蛋白的含量：
 

圖5
 

通過(guò)分析軟件BioAnaly計(jì)算灰度值，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，如圖6所示：
 

圖6
 

使用475nm的藍(lán)光（不同熒光染料所需波長(zhǎng)參照試劑的使用說(shuō)明）激發(fā)目的蛋白Test，結(jié)果如圖7所示:
 

圖7
 

通過(guò)分析軟件BioAnaly計(jì)算發(fā)光強(qiáng)度，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，如圖8所示：
 

圖8

從上圖可以看出，目的蛋白在S3中的發(fā)光強(qiáng)度最大，接近S2的2.5倍。然而經(jīng)過(guò)蛋白歸一化后，結(jié)果，如圖9所示：
 

圖9

我們不難發(fā)現(xiàn)目的蛋白在四份樣品中表達(dá)量基本一致，所以我們說(shuō)蛋白歸一化是必須的。相應(yīng)的，BioAnaly分析軟件也可以直接對(duì)總蛋白進(jìn)行歸一化分析。

兩種方法的對(duì)比
內(nèi)參蛋白校正
優(yōu)點(diǎn)
1、發(fā)展時(shí)間久，技術(shù)成熟；
2、成本低，不需要額外的染色；

缺點(diǎn)
1、需要根據(jù)不同的組織選擇不同的內(nèi)參蛋白，以保證樣品間的一致性；
2、內(nèi)參蛋白大小與目的蛋白大小相差5KD以上，防止發(fā)光時(shí)互相干擾；
3、內(nèi)參蛋白與目的蛋白表達(dá)量不能相差過(guò)大，防止內(nèi)參蛋白曝光過(guò)度；
4、需要證明內(nèi)參蛋白本身的表達(dá)量在各樣品間保持一致；

總蛋白校正
優(yōu)點(diǎn)
1、適用于任何組織樣本；
2、具有更好的說(shuō)服力，投稿更方便；

缺點(diǎn)
1、染料具有一定的線性范圍，需要一定程度上控制上樣量；
2、每次都需要對(duì)整張膜進(jìn)行染色，試劑使用量大；

總結(jié)
在Western Blot實(shí)驗(yàn)中，歸一化處理是關(guān)鍵步驟，歸一化以后才能進(jìn)行蛋白濃度的對(duì)比。其中，內(nèi)參蛋白校正由于其發(fā)展時(shí)間久、成本低等優(yōu)點(diǎn)，受眾多，積累了大量的使用經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)有豐富的試劑種類(lèi)可供選擇，對(duì)于常規(guī)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的研究是最佳方法；總蛋白校正則是直接測(cè)得整個(gè)泳道（樣本）內(nèi)所有蛋白的含量，不用擔(dān)心內(nèi)參蛋白本身帶來(lái)的誤差，對(duì)于沒(méi)有參考資料的新樣本來(lái)說(shuō)十分適合。所以，兩者是相輔相成的，大家可以根據(jù)自己的實(shí)際情況進(jìn)行選擇。

除了選擇合適的歸一化方法以外，一臺(tái)高靈敏度的光信號(hào)捕捉設(shè)備也是獲得理想實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所必需的。博鷺騰公司在光子信號(hào)的高效率識(shí)別接收領(lǐng)域有著多年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，旗下的GelView6000系列產(chǎn)品配備了科研級(jí)冷CCD相機(jī)、多色熒光光源以及功能強(qiáng)大的BioAnaly分析軟件，能對(duì)泳道內(nèi)的蛋白做精準(zhǔn)的定量和定性分析，完全兼容這兩種歸一化方法的需求，并且設(shè)備操作簡(jiǎn)便，5分鐘即可上手，歡迎各位老師咨詢(xún)?cè)囉谩?br />
電話：020-39337880
郵箱：support@bltlux.com