Nlrp3基因敲除小鼠與炎癥性疾病

賽業(yè)生物《每周一鼠》欄目，每周五更新，為大家講解一個(gè)小鼠模型的故事，希望對(duì)大家了解不同的疾病小鼠模型有所幫助。今天和大家見(jiàn)面的是Nlrp3基因編輯小鼠。

背景介紹
Nlrp3基因編碼一個(gè)pyrin樣蛋白，蛋白包含一個(gè)pyrin結(jié)構(gòu)域，一個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)富亮氨酸重復(fù)序列(LRR)基序。該蛋白與凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白PYCARD/ASC相互作用，PYCARD/ASC包含一個(gè)caspase招募域，是NLRP3炎癥小體復(fù)合體的成員。該復(fù)合物作為NF-kappaB信號(hào)的上游激活因子，并在炎癥、免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。
 

圖1. 炎癥小體的分子機(jī)制示意圖[1]

 

IL-1β，也稱為內(nèi)源性熱原，是一種高度炎癥細(xì)胞因子，其產(chǎn)生受到至少三個(gè)不同步驟的嚴(yán)格控制。第一步涉及pro-IL-1β蛋白（p35）的產(chǎn)生；隨后裂解pro-IL-1β前體以產(chǎn)生活性 IL-1β 蛋白 (p17)，最后將 IL-1β 釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。中間步驟，即 pro-IL-1β 的加工，涉及激活 caspase-1 激活復(fù)合物，其最佳特征是炎癥小體。NLRP3 炎癥小體將無(wú)活性的 pro-caspase-1 加工成有活性的 Caspase-1，它將pro-IL-1β裂解為成熟的 IL-1β，導(dǎo)致炎癥和細(xì)胞過(guò)早死亡。

編碼 Cryopyrin 的基因NLRP3的顯性遺傳突變被證明是導(dǎo)致一系列炎癥疾病的原因，包括家族性感冒自身炎癥綜合征 (FCAS)、Muckle -Wells 綜合征 (MWS) 和新生兒多系統(tǒng)炎癥性疾病 (NOMID) ，現(xiàn)在統(tǒng)稱為冷熱蛋白相關(guān)周期性綜合征 (CAPS)。

Nlrp3基因編輯小鼠表型
1. 點(diǎn)突變模型
丙氨酸 352 到纈氨酸 (A352V) 和亮氨酸 353 到脯氨酸 (L353P) 的突變分別與經(jīng)典 MWS 和 FCAS 患者密切相關(guān)，而在重疊綜合征患者中則不太相關(guān)。通過(guò)ES打靶技術(shù)生成兩個(gè)點(diǎn)突變小鼠模型：Nlrp3 A350V 和Nlrp3 L351P。因內(nèi)含子中Neo的存在，阻斷了基因的正常表達(dá)，通過(guò)交配不同啟動(dòng)子下表達(dá)Cre重組酶的小鼠介導(dǎo)Neo在不同部位刪除并表達(dá)突變基因。
 

圖2. Nlrp3 點(diǎn)突變小鼠打靶策略[3]

Nlrp3 A350V/+ / CreZ（胚胎期刪除Neo并表達(dá)突變基因）幼崽在出生后 1-2 天或之前表現(xiàn)出炎癥表型，在第 4 天出現(xiàn)皮膚膿腫，并出現(xiàn)鱗屑狀紅斑（圖3A）。此外，這些小鼠在第 4 天表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)延遲，缺乏色素沉著和毛發(fā)生長(zhǎng)。Nlrp3 A350V/+ / CreL（骨髓細(xì)胞系刪除Neo并表達(dá)突變基因)幼崽表現(xiàn)出相似的表型，但具有不同的死亡率動(dòng)力學(xué)，因此這些小鼠中有 70% 存活到第 7-9 天，然后以增加的速度死亡。
 

圖3. Nlrp3 點(diǎn)突變小鼠相關(guān)表型數(shù)據(jù)[3]

雖然與 MWS 患者中觀察到的蕁麻疹樣病變不同，但在表達(dá) A350V 的幼崽中觀察到的皮膚紅斑、膿腫和鱗屑表明存在潛在炎癥。突變小鼠總體白細(xì)胞計(jì)數(shù)僅輕度升高，但中性粒細(xì)胞和血小板增多是明顯的。在 CAPS 患者中一致描述了類似的血液學(xué)和皮膚檢查結(jié)果。來(lái)自Nlrp3 A350V/+ / CreL幼崽的發(fā)炎皮膚切片進(jìn)行了 IL-1β 和 IL-6 的免疫組織化學(xué)。兩種細(xì)胞因子（主要在真皮中的 IL-1β 和表皮中的 IL-6）的表達(dá)增加，與來(lái)自 CAPS 患者的皮膚活檢一致，并暗示這些細(xì)胞因子在皮膚病理學(xué)中的作用。TNFα 沒(méi)有顯著差異，這與先前描述的 CAPS 患者一致。
 

圖4. Nlrp3 點(diǎn)突變小鼠血清和皮膚中多種細(xì)胞因子上調(diào)[3]

2. 敲除小鼠模型

通過(guò)ES打靶技術(shù)生成Nlrp3 （Cias1)敲除小鼠模型，通過(guò)在ATG起始位置處插入EGFP達(dá)到敲除的目的：

圖5. Nlrp3基因敲除小鼠打靶策略[5]

野生型、Nlrp3+/-和Nlrp3-/-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的 pro-IL-1β，然而，與它們的野生型對(duì)應(yīng)物不同，Nlrp3-/-巨噬細(xì)胞在 ATP 處理后沒(méi)有切割 pro-IL-1β，表明，cryopyrin 對(duì)于 ATP 誘導(dǎo)的 caspase-1 激活至關(guān)重要；用 LPS或 Pam3CSK4 引發(fā)的野生型巨噬細(xì)胞響應(yīng)尼日利亞菌素或 maitotoxin分泌IL-1β和IL-18，相比之下，Asc-/-和Nlrp3-/-巨噬細(xì)胞均未釋放顯著的IL-1β或IL-18。

賽業(yè)“紅鼠資源庫(kù)”涵蓋16000品系基因敲除小鼠、條件性敲除小鼠及20萬(wàn)點(diǎn)突變位點(diǎn)小鼠品系，強(qiáng)大的數(shù)據(jù)庫(kù)給您更便捷的體驗(yàn)，研究人員能夠在線查詢、設(shè)計(jì)和優(yōu)化基因編輯方案并比較研究數(shù)據(jù)和成果，并咨詢訂購(gòu)。

“紅鼠資源庫(kù)”可以為您提供Nlrp3全身性敲除小鼠和Nlrp3條件性敲除小鼠研究Nlrp3相關(guān)炎癥性疾病，而且Nlrp3全身性敲除活體小鼠現(xiàn)在正在參與秒殺，48小時(shí)內(nèi)即可發(fā)貨，最后兩天，如有需要，歡迎聯(lián)系我們咨詢~
 

 

賽業(yè)生物基因編輯技術(shù)服務(wù)平臺(tái)

賽業(yè)生物成熟穩(wěn)定的基因編輯技術(shù)平臺(tái)每年構(gòu)建各類基因敲除載體、基因敲除細(xì)胞模型、基因敲除大小鼠模型上萬(wàn)例。從“敲除載體”、“敲除細(xì)胞模型”到“敲除大小鼠模型”，賽業(yè)生物經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)團(tuán)隊(duì)可為您提供專業(yè)的一站式服務(wù)。

 

品系豐富的基因編輯小鼠資源庫(kù)

基于AlphaKnockout基因打靶專家系統(tǒng)而建立的超16000品系“找小鼠，上紅鼠”CRISPR-AI敲除小鼠資源庫(kù)，涵蓋腫瘤、心血管、免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌和代謝等多個(gè)熱門(mén)研究方向，可快速查詢所需基因敲除小鼠、條件性敲除小鼠品系。該庫(kù)可劃分為三個(gè)板塊，強(qiáng)大的數(shù)據(jù)庫(kù)給您更便捷的體驗(yàn)。“超16000品系CRISPR-AI敲除小鼠資源庫(kù)”可快速查詢所需基因敲除小鼠、條件性敲除小鼠品系；“點(diǎn)突變小鼠數(shù)據(jù)庫(kù)”擁有超20萬(wàn)點(diǎn)突變位點(diǎn)，一鍵獲取小鼠模型突變位點(diǎn)詳情及建模指導(dǎo)；“microRNA敲除小鼠數(shù)據(jù)庫(kù)”可便捷搜索microRNA敲除小鼠造模方案。只需輸入基因名稱，一鍵查詢訂購(gòu)。

 

高效且智能化的模式動(dòng)物定制平臺(tái)

賽業(yè)生物扎根模式動(dòng)物定制領(lǐng)域15年，擁有多項(xiàng)技術(shù)創(chuàng)新。2016年，獨(dú)創(chuàng)的TurboKnockout技術(shù)把ES打靶金標(biāo)準(zhǔn)推向新高度；同年，特殊優(yōu)化的CRISPR-Pro使大片段敲入及條件性敲除變得更加高效。賽業(yè)模式動(dòng)物研究中心在江蘇太倉(cāng)（緊鄰上海）、廣州科學(xué)城核心區(qū)和河北固安（緊鄰北京）等地?fù)碛泄灿?jì)4萬(wàn)平方米動(dòng)物設(shè)施，配備有IVC飼養(yǎng)設(shè)備超過(guò)1600套，可養(yǎng)殖SPF級(jí)別大小鼠超過(guò)15萬(wàn)籠，動(dòng)物種群規(guī)模超過(guò)50萬(wàn)只。從健康檢測(cè)、遺傳控制到人員培訓(xùn)、個(gè)性化繁育等方面，全方位滿足您對(duì)模式動(dòng)物定制模型飼養(yǎng)繁育的要求。

 

細(xì)胞技術(shù)服務(wù)平臺(tái)

賽業(yè)生物扎根細(xì)胞領(lǐng)域十幾年，擁有超千例項(xiàng)目成功案例，超200種細(xì)胞株成功構(gòu)建經(jīng)驗(yàn)，多篇相關(guān)文獻(xiàn)引用發(fā)表，平臺(tái)成熟穩(wěn)定，成功保障，安全無(wú)憂。賽業(yè)生物細(xì)胞技術(shù)服務(wù)平臺(tái)可提供各類型的載體構(gòu)建、病毒包裝和過(guò)表達(dá)、干擾、基因敲除、點(diǎn)突變及基因敲入穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株服務(wù)。此外，賽業(yè)還可提供腫瘤細(xì)胞、體細(xì)胞常規(guī)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)、組織學(xué)檢測(cè)、細(xì)胞提取、干細(xì)胞干性分析和血管形成等常規(guī)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)服務(wù)。

 

參考文獻(xiàn)：

1. Stojanov S, Kastner DL. Familial autoinflammatory diseases: genetics, pathogenesis and treatment. Curr Opin Rheumatol. 2005 Sep;17(5):586-99. doi: 10.1097/bor.0000174210.78449.6b. PMID: 16093838.

2. Sutterwala FS, Ogura Y, Szczepanik M, Lara-Tejero M, Lichtenberger GS, Grant EP, Bertin J, Coyle AJ, Galán JE, Askenase PW, Flavell RA. Critical role for NALP3/CIAS1/Cryopyrin in innate and adaptive immunity through its regulation of caspase-1. Immunity. 2006 Mar;24(3):317-27. doi: 10.1016/j.immuni.2006.02.004. PMID: 16546100.

3. Kuemmerle-Deschner JB, Haug I. Canakinumab in patients with cryopyrin-associated periodic syndrome: an update for clinicians. Ther Adv Musculoskelet Dis. 2013 Dec;5(6):315-29. doi: 10.1177/1759720X13502629. PMID: 24294305; PMCID: PMC3836377.

4. Brydges SD, Mueller JL, McGeough MD, Pena CA, Misaghi A, Gandhi C, Putnam CD, Boyle DL, Firestein GS, Horner AA, Soroosh P, Watford WT, O'Shea JJ, Kastner DL, Hoffman HM. Inflammasome-mediated disease animal models reveal roles for innate but not adaptive immunity. Immunity. 2009 Jun 19;30(6):875-87. doi: 10.1016/j.immuni.2009.05.005. Epub 2009 Jun 4. PMID: 19501000; PMCID: PMC2759865.

5. Mariathasan S, Weiss DS, Newton K, McBride J, O'Rourke K, Roose-Girma M, Lee WP, Weinrauch Y, Monack DM, Dixit VM. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 2006 Mar 9;440(7081):228-32. doi: 10.1038/nature04515. Epub 2006 Jan 11. PMID: 16407890.