MDCK細胞的生物反應器微載體培養(yǎng)方法

MDCK細胞屬于動物細胞一般采用Cytodex 作為微載體Cytodex 主要有兩個系列 即：Cytodex 和 Cytopore ，其中 Cytodex 1適合大多數(shù)的貼壁細胞。

采用Cytodex 微載體的優(yōu)勢主要有以下幾點：
1. Cytodex 微載體的表面比較適宜細胞的粘附和延展。
2. 優(yōu)化后的大小和密度對于細胞懸浮較為有利，適宜細胞的生長和高產(chǎn)。
3. 這類細胞的細胞基質(zhì)具有一定的生物惰性，可以減少攪拌培養(yǎng)過程中的剪切力損害。
4. Cytodex 微載體具有較好的可放大性。試驗證明，良好的培養(yǎng)環(huán)境下采用搏旅懸浮細胞培養(yǎng)生物反應器可達 15,000 L產(chǎn)量規(guī)模，而采用貼壁細胞微載體培養(yǎng)生物反應器可達 6,000 L 左右的規(guī)模。
 

MDCK細胞的生物反應器微載體培養(yǎng)方法主要有以下幾個步驟：
一、微載體的前處理：
用pH為7.4的PBS緩沖液將Cytodex系列微載體浸泡3~24H;反復清洗后用高壓進行滅菌，冷卻。并用含牛血清的培養(yǎng)基清洗后并加入同體積的培養(yǎng)基備用。2）
二、MDCK種子細胞的解凍復蘇：
取出凍存中MDCK細胞，置于37℃-39℃的恒溫水浴振蕩器中進行解凍復蘇，再植入細胞培養(yǎng)瓶中進行細胞培養(yǎng)。
三、細胞的轉(zhuǎn)瓶擴培
當細胞培養(yǎng)瓶中的細胞生長到90%密度時用細胞消化液處理細胞，并接入搖瓶進行分瓶培養(yǎng)，當細胞生長到同樣密度時，用培養(yǎng)基稀釋接入生物反應器進行擴培。
四、生物反應器微載體培養(yǎng)：
MDCK細胞接種可以依照 比例為2-25g微載體/L（培養(yǎng)基）、5-50個細胞/載體的比例接入生物反應器中進行擴大培養(yǎng)。具體詳盡參數(shù)可以根據(jù)相關的《胞培養(yǎng)操作說明》進行設定調(diào)整。
五、病毒的感染接種：
當生物反應器內(nèi)培養(yǎng)的MDCK細胞90%在微載體表面形成致密層后，應當停止攪拌，當微載體沉淀于生物反應器的地步是，更新培養(yǎng)基，按照TPCK胰酶1-20μg/ml、病毒感染復數(shù)0.01-1接種病毒培養(yǎng)2h后，補充培養(yǎng)基與原來的量相一致；
六、病毒收獲
當病毒接種10H后，需要每小時取樣觀察細胞的病變效應及CPE值，當CPE值大達80%以上時，即可進行病毒收獲、分析測定等操作環(huán)節(jié)，結(jié)合分析結(jié)果與相關《檢驗規(guī)程》執(zhí)行下一步操作。

 

 

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