幾種基因敲除細(xì)胞株構(gòu)建方法的介紹與比較

眾所周知，CRISPR-Cas9作為一項(xiàng)基因編輯技術(shù)，目前已經(jīng)是生命科學(xué)領(lǐng)域家喻戶曉的技術(shù)了。但雖說(shuō)這項(xiàng)技術(shù)非常火爆，仍有許多同學(xué)對(duì)基因編輯技術(shù)存在理解偏差，比如最常見(jiàn)的，在應(yīng)用CRISPR-Cas9構(gòu)建基因敲除（KO）細(xì)胞系，到底采用質(zhì)粒法、病毒法還是有其他更好的方法呢？

說(shuō)到這個(gè)問(wèn)題，就不得不提當(dāng)初CRISPR-Cas9技術(shù)剛興起時(shí)，所展現(xiàn)的切割效率和敲除成功率極大的吸引了科研界的關(guān)注，但是科研人員進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)經(jīng)常會(huì)遇到：“一學(xué)就會(huì)，一做就廢”的問(wèn)題。他們發(fā)現(xiàn)，完全按照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行基因敲除，成功率并沒(méi)有想象的高，且還存在對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低的問(wèn)題。因此有一些課題組就嘗試通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式進(jìn)行敲除，提高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，將Cas9蛋白基因整合到基因組中，通過(guò)提高增加Cas9蛋白和sgRNA的作用時(shí)間來(lái)提高細(xì)胞敲除效率。
 

★ 慢病毒法 ★

但是，慢病毒感染存在著兩個(gè)比較關(guān)鍵的問(wèn)題：
1. 利用慢病毒法轉(zhuǎn)染Cas9會(huì)在敲除靶基因的同時(shí)引入新的基因，而且慢病毒轉(zhuǎn)染的外源基因是隨機(jī)整合，存在影響其他基因表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)。

2. CRISPR-Cas9編輯過(guò)程存在脫靶效應(yīng)，慢病毒法會(huì)持續(xù)表達(dá)Cas9蛋白，長(zhǎng)期存在的Cas9蛋白會(huì)對(duì)這種脫靶效應(yīng)有累積效應(yīng)，最終影響實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性。
 

圖1. 慢病毒感染進(jìn)行基因敲除

★ 質(zhì)粒法 ★

為了降低這種脫靶效應(yīng)，采用的策略是減少Cas9蛋白與sgRNA復(fù)合物在細(xì)胞中的存留時(shí)間，因此我們還可以采用質(zhì)粒法進(jìn)行KO細(xì)胞的構(gòu)建。即通過(guò)將Cas9和sgRNA表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到目的細(xì)胞中，從而在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Cas9蛋白和gRNA，由于質(zhì)粒整合到基因組的概率極低，隨著細(xì)胞傳代質(zhì)粒載體的逐漸消失，再經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證和測(cè)序篩選出純合的敲除細(xì)胞。但質(zhì)粒法也存在一個(gè)較大的問(wèn)題，即感染效率較低。

★ RNP法 ★

與質(zhì)粒法不同的是，RNP法是通過(guò)電刺激轉(zhuǎn)染的方法直接將Cas9蛋白和sgRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。由于Cas9蛋白是不帶電荷的，而sgRNA是帶電荷的，因此只有當(dāng)Cas9與sgRNA結(jié)合后，才能更高效的將兩者轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。同時(shí)，由于Cas9和sgRNA會(huì)被降解，Cas9-sgRNA復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的存留時(shí)間不會(huì)很長(zhǎng)，因此發(fā)生脫靶的概率很低，但相應(yīng)的切割效率也可能有一定降低。

圖2. Cas9蛋白與gRNA形成RNP復(fù)合物

從國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的情況來(lái)看，質(zhì)粒法和RNP法是目前主流的基因敲除策略，對(duì)于課題組實(shí)驗(yàn)室而言，質(zhì)粒法可能更容易實(shí)施，而對(duì)于生物技術(shù)企業(yè)，RNP法則具有更高的實(shí)驗(yàn)效率。但這兩種不同的方法只是殊途同歸，只要能達(dá)到敲除效果的就是好方法。
 

★ 賽業(yè)生物Smart-CRISPR™基因編輯系統(tǒng) ★

賽業(yè)生物獨(dú)創(chuàng)Smart-CRISPR™技術(shù)，是基于人工智能的AlphaKnockout基因編輯專家系統(tǒng)和CRISPR-Cas9技術(shù)自主開(kāi)發(fā)的細(xì)胞基因編輯系統(tǒng)，相比普通CRISPR-Cas9技術(shù)的基因切割效率更高，可輕松實(shí)現(xiàn)細(xì)胞移碼突變、片段敲除、多基因敲除等多種敲除策略，更好地解決蛋白陽(yáng)性殘留等問(wèn)題，基因編輯效率顯著提升，助力您發(fā)文更快速！歡迎大家聯(lián)系我們咨詢~