讓您的細胞高枕無憂的細胞房消毒方案
人為操作和環(huán)境我們大致可以從以下幾點進行考察分析：
操作人員、細胞房、生物安全柜、顯微鏡置物臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、水浴鍋、震動、滅菌鍋。
人源污染及預(yù)防
人類的皮膚總面積約2m2，存在約1012個微生物；我們1g的排遺物中約有1012個微生物。
-摘自上海高中生物第四冊第一章微生物
人源污染
那么我們?nèi)绾伪苊膺@些呢？接下來繼續(xù)探討~
1. 細胞房著裝要求操作細胞培養(yǎng)物前后應(yīng)洗手，穿戴個人防護設(shè)備不僅可保護您免受危險品污染，還可降低皮屑以及衣服上污物和灰塵污染培養(yǎng)物的可能。
正確的穿衣順序：- ① 換專用鞋
- ② 無塵手套（避免不潔的雙手經(jīng)穿著時沾附于無塵衣上）
- ③ 網(wǎng)帽（帶網(wǎng)帽時須確保頭發(fā)不可暴露于網(wǎng)帽外，之后戴口罩遮住口鼻）
- ④ 無塵服（不要穿棉質(zhì)衣服(脫落纖維)）
- ⑤ 鞋套
德克龍(聚酯)
超凈工作臺或安全柜里的物品擺放一般遵循以下右手使用習(xí)慣，并可根據(jù)特殊實驗中增加物品進行相應(yīng)的改動。
① 在工作臺中部開闊區(qū)域放置細胞培養(yǎng)容器；② 移液器置于右前方易于取用的地方；
③ 試劑和培養(yǎng)基置于右后方，便于吸取；
④ 試管架置于中后部，用于固定其他試劑；
⑤ 小型容器置于左后部，用于盛放廢液。
適合慣用右手的工作人員的工作臺基本布局。慣用左手的工作人員可相應(yīng)地調(diào)整工作臺面上物品的擺放位置。
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- 小心取用無菌實驗物品，勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，也不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
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- 每次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同也不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以75%酒精擦拭無菌操作臺面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。
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- 離心管、凍存管等容器需用抗酒精的標記筆標示內(nèi)容物名稱、操作日期、操作人員姓名。若是細胞傳代培養(yǎng)，更需注明目前的代數(shù)，以及這是同一代中的第幾盤。
細胞房布局技巧
1. 細胞房功能分區(qū)
理想的無菌操作室應(yīng)劃分為三部分：
a) 更衣室---放在外，主要提供更換衣帽，鞋子，口罩，手套等。b）緩沖室---位于更衣間與操作間之間，也可同時和幾個操作間相通。目的是保證操作間的無菌環(huán)境，同時可放置恒溫培養(yǎng)箱及某些必需的小型儀器。
c）操作室---放在內(nèi)間，分為無菌操作室、培養(yǎng)室、準備室、清洗室、消毒滅菌室、儲存室。
房間設(shè)置要求：各個房間高度適宜（不超過2.5m），頂部過高會影響紫外線的滅菌效果；大小適當(dāng)，房間過大，清掃和消毒不便；過小，操作不便；墻壁應(yīng)光滑無死角，以便清洗和消毒。
2. 細胞房設(shè)計原則及條件
條件要求：封閉、正壓：隔離門和空調(diào)系統(tǒng)
溫濕度：培養(yǎng)箱內(nèi)是37℃，飽和濕度；室內(nèi)是溫度18℃-26℃，濕度是45%-65%。潔凈度：空氣潔凈度等級是潔凈空間單位體積空氣中，以大于或等于被考慮粒徑的離子最大濃度限值進行劃分的等級標準。潔凈度等級應(yīng)在空態(tài)、靜態(tài)和動態(tài)放大進行測試，使用塵埃粒子測試儀來測定。
3. 細胞房布局原則
摘自：《Culture of Animal Cells》
細胞房維護保養(yǎng)：
1. 每天檢查并記錄細胞房溫度、相對濕度（細胞房溫濕度記錄表)，發(fā)現(xiàn)異常要及時報告并處理。2. 生物安全柜或超凈臺維護：每年委托有資質(zhì)第三方對生物安全柜或超凈臺進行風(fēng)速、氣流流型、高效測漏、塵埃粒子、沉降菌的檢測。
日常維護：定期對生物安全柜或超凈臺進行塵埃粒子、沉降菌或浮游菌的測試，發(fā)現(xiàn)不合格及時更換濾網(wǎng)或進行維修。
3. 空調(diào)系統(tǒng)維護: 定時更換初中效過濾器，每年請有資質(zhì)第三方對潔凈室進行塵埃粒子、沉降菌或浮游菌、換氣次數(shù)、高效測漏、壓差等檢測。
日常維護：按照要求定期監(jiān)測塵埃粒子、沉降菌或浮游菌。
細胞房消毒方法
1. 細胞培養(yǎng)箱防菌試劑
Pharmacidal （IC-110100）
主要成分：Pharmacidal 是由篩選過的有機氮化合物組成，主要組成成分為：芐基二甲基辛基氯化銨、芐索氯銨、三羥乙基胺，并添加丙二醇等清潔消毒劑。作用原理：Pharmacidal作用方式是使脂質(zhì)變性，分解細胞膜的雙層磷脂質(zhì)和增加細胞通透性，導(dǎo)致酶的滅活，蛋白質(zhì)沉淀，與DNA和RNA產(chǎn)生反應(yīng)。
特點： Pharmacidal 對大部分的細菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒都有效。
使用方法：
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可消毒橡膠手套、超凈臺面、桌面、顯微鏡臺、試劑瓶身等物體表面，噴涂完全濕潤，不需擦拭，自然風(fēng)干。
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培養(yǎng)箱內(nèi)壁噴涂完全濕潤后，等待10分鐘后，用無菌吸水紙吸干內(nèi)壁上的殘留液體。
2. 水浴鍋、水盤防菌試劑
Aquaguard-1 Aquaguard-2
貨號：01-867-1B 貨號：01-916-1B
主要成分：苯甲酸鈉 主要成分：2-溴代-2-硝基-1,3-丙二醇
用來消毒培養(yǎng)箱中的水盤，可有效殺滅細菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒；無毒；對不銹鋼無腐蝕性；不揮發(fā)。
用法：
1. 建議每兩周進行一次系統(tǒng)的清潔和消毒培養(yǎng)箱。
Aquaguard-2
用來消毒水浴鍋，可有效殺滅細菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒。
用法：
1. 建議每周進行一次系統(tǒng)的清潔和消毒水浴鍋。
2. 稀釋500倍即可使用，即將1L水中加入2ml的Aquaguard-2溶液。
3. 超凈臺、桌面、試劑瓶身消毒方案
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滅菌方法 |
作用原理 |
優(yōu)點 |
缺點 |
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Pharmacidal 噴壺
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季銨鹽作用方式是使脂質(zhì)變性。分解細胞膜的雙層磷脂和增加細胞通透性，導(dǎo)致酶失活，蛋白沉淀，與DNA和RNA產(chǎn)生反應(yīng)，可有效防止真菌、細菌（和芽孢）和包膜病毒（包括HIV等RNA病毒）的污染和生長。 |
滅菌徹底；無毒無 害；無刺激性；無 腐蝕性；可生物降 解 |
不能與肥皂或其他陰離子洗滌劑同用，也不能與碘或過氧化物(如過氧化氫、磺胺粉等)同用，否則會抵消其作用。 |
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酒精 |
乙醇的抗菌原理是使蛋白質(zhì)變性 |
高效滅菌；價格 實惠 |
易揮發(fā)，作用時間短；有刺激性；易燃 |
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新潔爾滅 （苯扎溴銨） |
季銨鹽類消毒劑屬于陽離子表面活性劑，能吸附帶陰離子的細菌并破壞細菌的細胞膜，增加細菌胞漿膜通透性, 使菌體胞漿物質(zhì)外滲,阻礙其代謝而起到殺滅作用。 |
可殺滅常見細菌、 真菌；刺激性低； 無腐蝕 |
不能與肥皂或其他陰離子洗滌劑同用，也不能與碘或過氧化物(如過氧化氫、磺胺粉等)同用，否則會抵消其作用。 |
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來蘇爾
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酚類可裂解并穿透細胞壁，使菌體蛋白凝集沉淀，快速殺 滅細胞。 |
可殺滅常見細菌、 真菌 |
刺激性強，易使橡膠制品變脆變硬 |
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滴露 |
酚類可裂解并穿透細胞壁，使菌體蛋白凝集沉淀，快速殺 滅細胞。 |
可殺滅常見細菌、 真菌 |
刺激性強，易使橡膠制品變脆變硬 |
4. 細胞房空氣消毒方案
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滅菌方法 |
作用原理 |
優(yōu)點 |
缺點 |
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紫外線燈殺菌 |
波長在220-300nm的紫外線稱為“殺生命區(qū)”，其中以260nm的殺菌力最強。紫外線作用于細胞DNA，使DNA鏈上相鄰的嘧啶形成嘧啶二聚體（如胸腺嘧啶二聚體），抑制了DNA復(fù)制。 |
能有效殺滅常見的微生 物如金黃色葡萄球菌、 大腸桿菌 |
穿透力差；有死角；與被照物的距離以不超過1.2m為宜；致癌 |
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甲醛 熏蒸 |
它能與蛋白質(zhì)中的氨基酸結(jié)合而使蛋白變性，使酶的活性消失。 |
滅菌徹底；不易燃、 不爆炸，不腐蝕金屬 |
殘留性大；致癌 |
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過氧化氫 干霧滅菌 |
通過復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)解離具有高活性的羥基作用于細胞膜，其強氧化性破壞組成細菌的蛋白質(zhì)，使之死亡。 |
滅菌徹底；殘留性小 |
有腐蝕；易爆；致癌 |
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臭氧滅菌 |
高壓電場使電子管的內(nèi)外電極發(fā)生強烈電子轟擊，導(dǎo)致空氣電離而將空氣中的氧轉(zhuǎn)換成臭氧。臭氧不穩(wěn)定，很快自行分解成氧氣（O2）和單個氧原子（O）；后者具有很強的活性，能同細菌的胞膜及酶蛋白氫硫基進行氧化分解反應(yīng)，從而靠氧原子的彌漫性擴散達到殺菌之目的。 |
滅菌徹底；殘留性小 |
費用較為昂貴 |
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空氣過濾 （恒溫恒濕裝置） |
逐次使用不同孔徑的濾膜將微生物過濾干凈 |
除菌效果高；無毒 |
費用較為昂貴 |
5. 細胞房地面消毒方案
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滅菌劑 |
作用原理 |
優(yōu)點 |
缺點 |
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Pharmacidal 噴壺 |
季銨鹽作用方式是使脂質(zhì)變性。分解細胞膜的雙層磷脂和增加細胞通透性，導(dǎo)致酶失活，蛋白沉淀，與DNA和RNA產(chǎn)生反應(yīng)，可有效防止真菌、細菌（和芽孢）和包膜病毒（包括HIV等RNA病毒）的污染和生長。 |
滅菌徹底；無毒無害；無刺激性；無腐蝕性；可生物降解 |
不能與肥皂或其他陰離子洗滌劑同用，也不能與碘或過氧化物(如過氧化氫、磺胺粉等)同用，否則會抵消其作用。 |
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84消毒液
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84消毒殺菌最主要的作用方式是通過它的水解作用形成次氯酸，次氯酸再進一步分解形成新生態(tài)氧[O]，新生態(tài)氧的極強氧化性使菌體和病毒的蛋白質(zhì)變性，從而使病原微生物致死。 |
滅菌徹底；殘留性��；價格便宜 |
有腐蝕 |
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新潔爾滅 （苯扎溴銨） |
季銨鹽類消毒劑屬于陽離子表面活性劑，能吸附帶陰離子的細菌并破壞細菌的細胞膜，增加細菌胞漿膜通透性, 使菌體胞漿物質(zhì)外滲,阻礙其代謝而起到殺滅作用。 |
可殺滅常見細菌、真菌；刺激性低；無腐蝕 |
不能與肥皂或其他陰離子洗滌劑同用，也不能與碘或過氧化物(如過氧化氫、磺胺粉等)同用，否則會抵消其作用。 |
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來蘇爾
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酚類可裂解并穿透細胞壁，使菌體蛋白凝集沉淀，快速殺滅細胞。 |
可殺滅常見細菌、真菌 |
刺激性強，易使橡膠制品變脆變硬 |
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滴露 |
酚類可裂解并穿透細胞壁，使菌體蛋白凝集沉淀，快速殺滅細胞。 |
可殺滅常見細菌、真菌 |
刺激性強，易使橡膠制品變脆變硬 |
細胞污染殺除試劑
細菌克星-抗生素
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貨號 |
抗生素 |
作用對象 |
使用比例 |
儲存條件 |
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03-049-1B |
卡那霉素溶液（10mg/ml） |
細菌（如G+、G-、支原體） |
稀釋:1:100 |
-20ºC |
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03-035-1B |
硫酸慶大霉素溶液（50 mg/ml） |
細菌（如G+、G-、支原體） |
稀釋: 1:1000 |
AMB室溫 |
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03-031-1B |
青鏈雙抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate） |
細菌（如G+、G-） |
稀釋: 1:100 |
-20ºC |
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03-031-5B |
青鏈雙抗，10濃縮液（10X Conc., 100,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 100mg/ml, Streptomycin Sulfate） |
細菌（如G+、G-） |
稀釋: 1:1000 |
-20ºC |
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03-032-1B |
青鏈霉素，制霉菌素三抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 1,250 units/ml Nystatin） |
細菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋: 1:100 |
-20ºC |
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03-033-1B |
青鏈霉素，兩性霉素B三抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 25 ug/ml Amphotericin B） |
細菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋: 1:100 |
-20ºC |
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03-034-1B |
青鏈霉素，新霉素三抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 25mg/ml Neomycin Sulfate） |
細菌（如G+、G-） |
稀釋: 1:100 |
-20ºC |
真菌克星-抗生素
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貨號 |
抗生素 |
作用對象 |
使用比例 |
儲存條件 |
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03-029-1B |
兩性霉素（2500ug/ml） |
真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋:1:1000 ~ 1: 10,000 |
-20ºC |
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03-030-1C |
制霉菌素（10,000units/ml） |
真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋:1:100 to 1:1000 |
-20ºC |
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03-032-1B |
青鏈霉素，制霉菌素三抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 1,250 units/ml Nystatin） |
細菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋: 1:100 |
-20ºC |
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03-033-1B |
青鏈霉素，兩性霉素B三抗（10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 25 ug/ml Amphotericin B） |
細菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋: 1:100 |
-20ºC |
支原體檢測試劑
支原體檢測試劑盒的特異性：
引物與美國國家生物技術(shù)中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫進行比對，并檢測16S，rRNA靶區(qū)同源性。96種支原體具有相關(guān)序列同源性。
支原體殺除試劑
BIOMYC-1（貨號：03-036-1B）、BIOMYC-2（貨號：03-037-1B）、BIOMYC-3（貨號03-038-1B）
方案一：
BIOMYC-1（03-036-1B）和BIOMYC-2（03-037-1B）的使用方法：
1. 加 1ml的 BIOMYC-1 溶液至 100ml培養(yǎng)基中，保持受污染的細胞在混合液中培養(yǎng) 4 天。期間需加入含 BIOMYC-1 溶液的少許的新培養(yǎng)基；
2. 4天后，加1ml BIOMYC-2 溶液至 100ml 的新培養(yǎng)基中，并維持培養(yǎng) 3 天；
3. 以上是一個處理循環(huán)階段，可繼續(xù)2-3次如上處理循環(huán)。
4. 在處理過程中，細胞需要做支原體污染檢測，以確認效果，從而適當(dāng)減少實驗過程。
方案二：
BIOMYC-3（03-038-1B）的使用方法：
1. 加1ml BIOMYC-3至100ml培養(yǎng)基中；
2. 持續(xù)培養(yǎng)14天，期間每2-3天更換一次含BIOMYC-3培養(yǎng)基;
3. 14天后，用不含BIOMYC-3的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞14天后再做支原體檢測。
經(jīng)濟考慮，用戶選擇一種方案即可；最佳方案是，客戶先用方案一處理一周期，再用方案二處理一周期。
友情提示：如果使用其中一種方案，不能根除支原體，說明該支原體可能在另一種方案的抑菌譜內(nèi)；36，37，38三者聯(lián)合可有效根除實驗室95%以上的支原體污染。
黑膠蟲殺除試劑
BIOMYC-1（03-036-1B）、BIOMYC-2（03-037-1B）、BIOMYC-3（03-038-1B）
三抗 03-033-1B（主要成分：青、鏈、兩性霉素。）
黑膠蟲殺除方案一：
BIOMYC-1（03-036-1B）和BIOMYC-2（03-037-1B）和三抗（03-033-1B）的使用方法：
- 加1ml的 BIOMYC-1和三抗溶液至100ml培養(yǎng)基中，保持受污染的細胞在混合液中培養(yǎng)4天。期間需加入含BIOMYC-1和三抗溶液的少許的新培養(yǎng)基；
- 4天后，加1mlBIOMYC-2和三抗溶液至100ml的新培養(yǎng)基中，并維持培養(yǎng) 3天；
- 以上是一個處理循環(huán)階段，必要時可繼續(xù)2-3次如上處理循環(huán)。
- 在處理過程中，細胞需要做支原體污染檢測，以確認效果，從而適當(dāng)減少實驗過程。
BIOMYC-3（03-038-1B）和三抗（03-033-1B）的使用方法：
- 加1mlBIOMYC-3和三抗溶液至100ml培養(yǎng)基中；
- 持續(xù)培養(yǎng)14天，期間每2-3天更換一次培養(yǎng)基;
- 14天后，用不含BIOMYC-3和三抗溶液的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞14天后再做支原體檢測。
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