Per2基因敲除小鼠與晝夜節(jié)律研究

賽業(yè)生物《每周一鼠》欄目，每周五更新，為大家講解一個(gè)小鼠模型的故事，希望對(duì)大家了解不同的疾病小鼠模型有所幫助。今天和大家見(jiàn)面的是Per2基因編輯小鼠。

PER2與睡眠時(shí)相前移綜合征
2017年，因發(fā)現(xiàn)控制晝夜節(jié)律，即生物鐘的分子機(jī)制而被授予諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的三位科學(xué)家（杰弗里·霍爾, 邁克爾·羅斯巴什以及邁克爾·楊）的系列工作，使節(jié)律生物學(xué)成為一個(gè)廣闊而充滿活力的研究領(lǐng)域，為人類的健康和幸福帶來(lái)了深遠(yuǎn)的影響。

關(guān)于這三位獲獎(jiǎng)?wù)邔?duì)生物鐘基因的研究，要從一個(gè)早睡早起的家族說(shuō)起。這個(gè)家族成員總在晚上6、7點(diǎn)就睡覺(jué)，凌晨3、4點(diǎn)就起床。這和大部分人的生活習(xí)慣很不一樣。研究發(fā)現(xiàn)這是由PER2基因發(fā)生突變而導(dǎo)致的。PER2是Period基因家族的成員，在哺乳動(dòng)物大腦的主要晝夜節(jié)律起搏器-視交叉上核中以晝夜節(jié)律模式表達(dá)。

PER2基因突變導(dǎo)致的這種睡眠障礙叫做睡眠時(shí)相前移綜合征，是一種睡眠時(shí)間和警覺(jué)高峰期相對(duì)于社會(huì)時(shí)鐘提前幾個(gè)小時(shí)的疾病�；加写税Y的人通常很難保持清醒，除非他們很早就睡覺(jué)，因?yàn)樗麄兊膬?nèi)部時(shí)鐘已經(jīng)處于相對(duì)安靜的狀態(tài)，并且很早就醒來(lái)，在早上被認(rèn)為是“正常”的時(shí)間，無(wú)法重新入睡，因?yàn)樗麄兊膬?nèi)部時(shí)鐘已經(jīng)產(chǎn)生了強(qiáng)烈的警報(bào)信號(hào)。個(gè)人是“早起的百靈鳥(niǎo)”，睡眠、體溫和褪黑激素節(jié)律提前 4 小時(shí)左右。

睡眠質(zhì)量不會(huì)因該綜合癥而受損，但如果患者推遲就寢時(shí)間，可能會(huì)導(dǎo)致睡眠時(shí)間短。盡管如此，患有此癥的人并沒(méi)有報(bào)告該綜合癥影響他們白天的工作或?qū)W�；顒�(dòng)。他們最常見(jiàn)的抱怨是，由于需要比正常情況早得多的睡眠時(shí)間，他們晚上的活動(dòng)被縮短了，這會(huì)影響家庭和社會(huì)關(guān)系�；加写司C合癥的人在下午晚些時(shí)候和晚上開(kāi)車時(shí)應(yīng)該小心，因?yàn)樗麄兛赡芴�困了，他們也不能很好地適應(yīng)晚上或夜班。

睡眠時(shí)相前移綜合征在一般人群中的流行情況尚不清楚，但它在老年人中最為普遍。睡眠時(shí)相前移綜合征在男性和女性中發(fā)病率相同。研究人員還發(fā)現(xiàn)了一種強(qiáng)有力的基因聯(lián)系: 該疾病具有很強(qiáng)的家族傾向，40-50%的受影響個(gè)體的親屬患有此癥，這是一種常染色體顯性遺傳特征。

PER2與腫瘤
PER2是Period基因家族的成員，該基因的多態(tài)性可能會(huì)增加患某些癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。目前研究證明：PER1和PER2在胃癌、結(jié)腸癌、頭頸鱗癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病、黑色素瘤、肝細(xì)胞癌和乳腺癌等癌癥中表達(dá)顯著下調(diào)。PER3在結(jié)直腸癌、頭頸鱗癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌和肝細(xì)胞癌等癌癥中表達(dá)顯著下調(diào)。這表明PER2對(duì)正常功能是不可或缺的，而PER2表達(dá)水平的降低會(huì)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

Per2基因敲除小鼠表型
晝夜節(jié)律行為^[1]
有研究將純合敲除小鼠及其野生型和雜合同窩仔單獨(dú)安置在晝夜節(jié)律活動(dòng)監(jiān)測(cè)室中。對(duì)每只動(dòng)物的輪跑活動(dòng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，這是對(duì)嚙齒動(dòng)物晝夜節(jié)律活動(dòng)的精確測(cè)量的一種方式。小鼠最初在12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗（LD12:12，或LD）循環(huán)中保持10天以建立夾帶，隨后保持在恒定黑暗（DD）中。在黑暗中22天后，將動(dòng)物暴露在6小時(shí)的光脈沖下，隨后在黑暗中再保持11天。野生型小鼠表現(xiàn)出對(duì) LD 周期的精確夾帶，并且在持續(xù)的黑暗中，它們建立了一個(gè)周期略小于24小時(shí)的晝夜節(jié)律。

純合敲除小鼠的第一個(gè)表型是短晝夜節(jié)律:
在DD開(kāi)始或光脈沖之后，純合小鼠通常表現(xiàn)出數(shù)天的短周期。當(dāng)晝夜節(jié)律在活動(dòng)記錄上看起來(lái)穩(wěn)定時(shí)，通過(guò)對(duì)時(shí)間間隔的x2周期圖分析計(jì)算周期長(zhǎng)度。野生型對(duì)照的平均時(shí)間為23.7±0:4 h。相比之下，純合突變體小鼠的平均周期為 22.1±0:4 h。雜合突變體的穩(wěn)定期平均為 23.6±0:4 h ，這與它們的野生型同窩仔沒(méi)有顯著差異。因此，純合突變體表現(xiàn)出明顯短于其野生型兄弟姐妹的時(shí)期。

名詞解釋：夾帶是內(nèi)部生物鐘節(jié)律（包括其相位和周期）與外部時(shí)間線索（例如自然暗光周期）的同步或?qū)��?zhǔn)。

圖1. 小鼠代表性運(yùn)動(dòng)活動(dòng)記錄

純合敲除小鼠的第二個(gè)表型是在持續(xù)的黑暗中喪失持續(xù)的晝夜節(jié)律:
由純合突變體表現(xiàn)的短時(shí)期之后是晝夜節(jié)律的喪失。單個(gè)純合突變體失去其晝夜節(jié)律所需的時(shí)間各不相同，根據(jù)活動(dòng)圖的評(píng)估，大部分時(shí)間在2到18天之間。為了量化晝夜節(jié)律，在持續(xù)黑暗的第1-10天（第一個(gè)間隔）和第6-15天（第二個(gè)間隔）對(duì)三種基因型進(jìn)行了傅立葉周期圖分析。對(duì)于野生型小鼠，第一個(gè)和第二個(gè)間隔的晝夜節(jié)律峰值幅度的對(duì)數(shù)平均值分別為2.72±0.14和2.80±0.17，雜合子小鼠分別是：2.85±0.08和 2.88±0.07，對(duì)于純合突變體則分別是：2.19±0.30和1.80±0.35。對(duì)來(lái)自沒(méi)有明顯晝夜節(jié)律的純合突變體的活性數(shù)據(jù)的傅立葉分析證實(shí)了晝夜節(jié)律峰的喪失，但檢測(cè)到了4-8小時(shí)的周期性。
 

圖2. 小鼠周期性的傅立葉分析

腫瘤抑制^[2]
有研究表明新生的純合Per2敲除小鼠在形態(tài)上是正常的。6個(gè)月大時(shí)的組織學(xué)檢查大多數(shù)器官系統(tǒng)未發(fā)現(xiàn)異常，但純合敲除的雄性和雌性開(kāi)始表現(xiàn)出唾液腺增生和畸胎瘤，主要是雄性的表皮。到12個(gè)月大時(shí)，所有純合敲除小鼠都表現(xiàn)出唾液腺增生，所有雄性純合敲除小鼠在生殖器區(qū)域周圍都出現(xiàn)了畸胎瘤。此外，所研究的純合敲除小鼠中有30%在16個(gè)月大之前死亡。病理分析表明，15%的純合敲除小鼠死于淋巴瘤。純合敲除小鼠的瘤形成頻率與野生型小鼠顯著不同。因此，純合敲除小鼠易患癌癥。
 

圖3. Per2敲除的增生生長(zhǎng)和輻射誘導(dǎo)淋巴瘤

在8周齡時(shí)，對(duì)野生型和純合突變小鼠在授時(shí)因子10(ZT10)時(shí)單次給予4Gy的全身γ輻射，并監(jiān)測(cè)疾病和存活情況。在照射后12周時(shí)，50%的純合突變小鼠觀察到頭發(fā)變白。照射后22周時(shí)，所有受照射的純合突變小鼠均出現(xiàn)白發(fā)，其中30%的小鼠背部或頸部和嘴巴周圍也出現(xiàn)大面積脫發(fā)。受照射的純合突變小鼠也表現(xiàn)出更早的增生性生長(zhǎng)。照射后7個(gè)月，所有受照射的雄性純合突變小鼠均觀察到畸胎瘤。
 

圖4. 突變小鼠對(duì)γ輻射的敏感性增加

Per2基因不僅對(duì)維持和調(diào)節(jié)生物晝夜節(jié)律具有重要作用，Per2基因的表達(dá)和節(jié)律異常改變與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。對(duì)Per2基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展的深入研究有可能為預(yù)防和治療癌癥提供新的方法和有效靶標(biāo)。

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參考文獻(xiàn)：

1. Zheng, B., Larkin, D., Albrecht, U. et al. The mPer2 gene encodes a functional component of the mammalian circadian clock. Nature 400, 169–173 (1999). https://doi.org/10.1038/22118

2. Fu L, Pelicano H, Liu J, Huang P, Lee C. The circadian gene Period2 plays an important role in tumor suppression and DNA damage response in vivo. Cell. 2002 Oct 4;111(1):41-50. doi: 10.1016/s0092-8674(02)00961-3. Erratum in: Cell 2002 Dec 27;111(7):1055. PMID: 12372299.