論文解讀：線性泛素化調(diào)控血管生成的新機(jī)制

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所的張令強(qiáng)團(tuán)隊(duì)和賀福初團(tuán)隊(duì)聯(lián)合哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的魏文毅團(tuán)隊(duì)和中科院微生物所的劉翠華團(tuán)隊(duì)近日在Molecular Cell雜志上發(fā)文，解析了線性泛素化調(diào)控血管生成的新機(jī)制。
 

泛素化通過泛素鏈與底物的結(jié)合來控制蛋白質(zhì)降解和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終影響每一個(gè)細(xì)胞過程。通過N端甲硫氨酸殘基（M1）連接形成的泛素鏈又稱為線性泛素鏈，在NF-kB介導(dǎo)的炎癥和免疫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用。

線性泛素鏈組裝復(fù)合物（LUBAC）由泛素連接酶HOIP和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基HOIL-1L和SHARPIN組成，負(fù)責(zé)在NEMO、RIPK1、RIPK2等底物上形成線性泛素鏈。OTULIN則是一種特異性去除線性泛素鏈的去泛素化酶。OTULIN與LUBAC協(xié)同作用，編輯線性泛素鏈，在胚胎發(fā)育、自身免疫和炎性疾病等過程中起作用。然而，線性泛素化調(diào)控血管生成的具體機(jī)制仍不清楚。

ALK1是線性泛素化修飾的底物
為了確定線性泛素鏈在胚胎發(fā)育中的生理功能，研究人員首先生成了Otulin缺陷型小鼠。他們發(fā)現(xiàn)，OTULIN全敲除和血管內(nèi)皮細(xì)胞敲除小鼠均在胚胎E13.5天死亡，并且存在畸形的血管結(jié)構(gòu)。相比之下，OTULIN心內(nèi)膜敲除小鼠則正常出生，沒有血管生成缺陷。因此，他們認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells, EC）中的OTULIN是胚胎發(fā)育血管生成所必需的，其缺失導(dǎo)致嚴(yán)重的血管生成缺陷，尤其是動(dòng)靜脈畸形。

在研究背后的機(jī)制時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)E12.5天時(shí)Otulin-KO胚胎中Smad1/5的C端磷酸化降低，而Smad2/3和Smad1的MH1-MH2接頭的C端磷酸化沒有改變。這可能解釋了Otulin-null表型。之后他們篩選了Smad1/5的I型受體，發(fā)現(xiàn)只有ALK1被線性泛素鏈特異性修飾。后續(xù)的一系列實(shí)驗(yàn)表明，ALK1是線性泛素化修飾的特異性底物。
 

圖1. 用anti-Flag抗體免疫沉淀細(xì)胞裂解液。使用免疫印跡法檢測(cè)免疫沉淀物以檢測(cè)線性泛素化。NEMO 用作陽性對(duì)照。

ALK1的線性泛素化降低下游Smad1/5信號(hào)傳導(dǎo)
研究人員發(fā)現(xiàn)，HOIP抑制劑11a限制了ALK1上線性泛素鏈的形成。為了在體內(nèi)證實(shí)這些結(jié)果，他們用BMP9（ALK1刺激物）來處理原代HUVEC細(xì)胞，并使用11a來抑制線性泛素鏈的形成，發(fā)現(xiàn)Smad1/5磷酸化和下游靶標(biāo)的表達(dá)被抑制劑11a所增強(qiáng)。相反，泛素連接酶HOIP的異位過表達(dá)減弱了Smad1/5磷酸化和下游靶標(biāo)表達(dá)。之后，通過突變體構(gòu)建和結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析，他們證明ALK1的線性泛素化會(huì)抑制ALK1的激酶活性，降低ALK1- Smad1/5信號(hào)傳導(dǎo)。

既然如此，那么OTULIN是否對(duì)ALK1進(jìn)行去泛素化，繼而促進(jìn)Smad1/5激活？他們發(fā)現(xiàn)，正如預(yù)期的那樣，OTULIN切割了LUBAC催化的ALK1上的線性泛素鏈。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明，OTULIN的缺失促進(jìn)了ALK1的線性泛素化，并伴隨著Smad1/5磷酸化和下游靶標(biāo)表達(dá)的降低。這些結(jié)果表明，OTULIN從ALK1上切割線性泛素鏈以釋放ALK1激酶活性，并促進(jìn)Smad1/5激活。

接著，為了證實(shí)ALK1是線性泛素化的真正生理靶點(diǎn)并導(dǎo)致Otulin-null敲除胚胎致死，研究人員打算在E12.5 Otulin-null胚胎中的ALK1激酶活性被限制之前補(bǔ)償ALK1-Smad1/5信號(hào)強(qiáng)度，以挽救Otulin-null胚胎的表型。他們提前在懷孕小鼠腹膜內(nèi)注射BMP9，發(fā)現(xiàn)Otulin-null胚胎的存活時(shí)間延長(zhǎng)。為了進(jìn)一步確認(rèn)減弱的ALK1激酶活性是否是在E13.5觀察到的胚胎致死的原因，他們還委托賽業(yè)生物構(gòu)建了EC條件性敲入小鼠ALK1Q200D（小鼠ALK1的Q200D突變導(dǎo)致ALK1組成型激活），發(fā)現(xiàn)這些胚胎的存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)。這些實(shí)驗(yàn)表明，Smad1/5磷酸化的增強(qiáng)是Otulin-null胚胎存活所必需的，而BMP9刺激或ALK1的組成型激活可延長(zhǎng)這些胚胎的存活時(shí)間。
 

圖2. 通過注射BMP9以及EC條件性敲入ALK1Q200D可以延長(zhǎng)Otulin EC-KO胚胎的存活時(shí)間。

HOIP抑制劑可挽救患者來源EC的異常表型
之前的研究表明，ALK1中的突變會(huì)引起2型遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥（HHT2），這是一種常染色體顯性的血管疾病，患者因動(dòng)靜脈畸形而在多個(gè)部位出現(xiàn)明顯的血管病變。因此，研究人員想了解HHT相關(guān)的ALK1突變是否會(huì)影響ALK1與HOIP之間的相互作用以及隨后的ALK1線性泛素化。

他們篩選了25例攜帶ALK1突變的HHT患者家系，發(fā)現(xiàn)一對(duì)母子攜帶了ALK1 G309S突變。后續(xù)分析表明，ALK1G309S突變體表現(xiàn)出過度的線性泛素化以及與HOIP的相互作用增加，這導(dǎo)致ALK1G309S的激酶活性較低。隨后，他們利用患者的外周血單核細(xì)胞制備出誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，然后誘導(dǎo)其分化為內(nèi)皮細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)HOIP抑制劑11a能夠校正患者的異常表型。

小結(jié)
總的來說，作者通過一系列的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了OTULIN與LUBAC協(xié)同作用，通過特異性編輯ALK1的線性泛素化來平衡內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。ALK1的過度線性泛素化對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有害，并導(dǎo)致Otulin-KO小鼠的血管生成缺陷和胚胎致死，這可以通過BMP9處理和ALK1激活來挽救。此外，HOIP抑制劑可使內(nèi)皮ALK1-Smad1/5正�；�，從而有效對(duì)抗與HHT發(fā)病相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞中的血管生成缺陷。
 

原文檢索：

Fu et al., OTULIN allies with LUBAC to govern angiogenesis by editing ALK1 linear polyubiquitin, Molecular Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.05.031