NLRP3基因敲除小鼠與家族性冷自身炎癥綜合征

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NLRP3基因簡(jiǎn)介
Nlrp3基因編碼一個(gè)pyrin樣蛋白，蛋白包含一個(gè)pyrin結(jié)構(gòu)域，一個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)富亮氨酸重復(fù)序列(LRR)基序。該蛋白與凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白PYCARD/ASC相互作用，PYCARD/ASC包含一個(gè)caspase招募域，是NLRP3炎癥小體復(fù)合體的成員。該復(fù)合物作為NF-kappaB信號(hào)的上游激活因子，并在炎癥、免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。
 

圖1. 炎癥小體的分子機(jī)制示意圖[1]

IL-1β，也稱為內(nèi)源性熱原，是一種高度炎癥細(xì)胞因子，其產(chǎn)生受到至少三個(gè)不同步驟的嚴(yán)格控制。第一步涉及pro-IL-1β蛋白（p35）的產(chǎn)生；隨后裂解pro-IL-1β前體以產(chǎn)生活性 IL-1β 蛋白 (p17)，最后將 IL-1β 釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。中間步驟，即 pro-IL-1β 的加工，涉及激活 caspase-1 激活復(fù)合物，其最佳特征是炎癥小體。NLRP3 炎癥小體將無(wú)活性的 pro-caspase-1 加工成有活性的 Caspase-1，它將pro-IL-1β裂解為成熟的 IL-1β，導(dǎo)致炎癥和細(xì)胞過(guò)早死亡。

編碼 Cryopyrin 的基因NLRP3的顯性遺傳突變被證明是導(dǎo)致一系列炎癥疾病的原因，包括家族性感冒自身炎癥綜合征 (FCAS)、Muckle -Wells 綜合征 (MWS) 和新生兒多系統(tǒng)炎癥性疾病 (NOMID) ，現(xiàn)在統(tǒng)稱為冷熱蛋白相關(guān)周期性綜合征 (CAPS)。
 

表1. FCAS的基本信息

備注：標(biāo)有√的意為賽業(yè)紅鼠資源庫(kù)有該種保存狀態(tài)的小鼠

家族性冷自身炎癥綜合征
家族性冷自身炎癥綜合征 (FCAS)，是一種罕見的遺傳性炎癥性疾病，其特征是間歇性發(fā)作的皮疹、發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛和其他因暴露于寒冷而引發(fā)的全身性炎癥的體征/癥狀FCAS的發(fā)病發(fā)生在嬰兒期和幼兒期，并在患者的一生中持續(xù)存在。FCAS通常在常染色體顯性遺傳條件下遺傳，并且是由編碼冷蛋白(NALP3)蛋白的CIAS1/NLRP3基因中的雜合突變引起的。假設(shè)該基因的突變會(huì)導(dǎo)致含有冷蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物的活性增加。這種蛋白質(zhì)復(fù)合物被稱為炎癥小體，可調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥。炎癥小體活性增加導(dǎo)致稱為IL-1ß的蛋白質(zhì)釋放增加，從而導(dǎo)致炎癥癥狀，如發(fā)燒和關(guān)節(jié)痛。

由于FCAS是一種新發(fā)現(xiàn)的疾病，目前很難確定該疾病的實(shí)際發(fā)病率和患病率。新生兒多系統(tǒng)炎性疾病(NOMID)和Muckle-Wells綜合征 (MWS) 癥狀可能與FCAS的癥狀相似，并且存在顯著的表型重疊。家族性冷自身炎癥綜合征1 (FCAS1) 是由NLRP3基因中的雜合突變引起，位于染色體1q44。另外FCAS2由染色體19q13上的 NLRP12基因突變引起；FCAS3由染色體16q23上的PLCG2基因突變引起；FCAS4由染色體2p22上的NLRC4基因突變引起。
 

圖2. 冷卟啉相關(guān)周期性綜合征(CAPS)的臨床譜[2]
 

表2. FCAS疾病相關(guān)信息

Nlrp3基因編輯小鼠表型

1. 點(diǎn)突變模型
丙氨酸 352 到纈氨酸 (A352V) 和亮氨酸 353 到脯氨酸 (L353P) 的突變分別與經(jīng)典 MWS 和 FCAS 患者密切相關(guān)，而在重疊綜合征患者中則不太相關(guān)。通過(guò)ES打靶技術(shù)生成兩個(gè)點(diǎn)突變小鼠模型：Nlrp3 A350V 和Nlrp3 L351P。因內(nèi)含子中Neo的存在，阻斷了基因的正常表達(dá)，通過(guò)交配不同啟動(dòng)子下表達(dá)Cre重組酶的小鼠介導(dǎo)Neo在不同部位刪除并表達(dá)突變基因。
 

圖3. Nlrp3 點(diǎn)突變小鼠打靶策略[3]

Nlrp3 A350V/+ / CreZ（胚胎期刪除Neo并表達(dá)突變基因）幼崽在出生后 1-2 天或之前表現(xiàn)出炎癥表型，在第 4 天出現(xiàn)皮膚膿腫，并出現(xiàn)鱗屑狀紅斑（圖3A）。此外，這些小鼠在第 4 天表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)延遲，缺乏色素沉著和毛發(fā)生長(zhǎng)。Nlrp3 A350V/+ / CreL（骨髓細(xì)胞系刪除Neo并表達(dá)突變基因)幼崽表現(xiàn)出相似的表型，但具有不同的死亡率動(dòng)力學(xué)，因此這些小鼠中有 70% 存活到第 7-9 天，然后以增加的速度死亡。
 

圖4. Nlrp3 點(diǎn)突變小鼠相關(guān)表型數(shù)據(jù)[3]

雖然與 MWS 患者中觀察到的蕁麻疹樣病變不同，但在表達(dá) A350V 的幼崽中觀察到的皮膚紅斑、膿腫和鱗屑表明存在潛在炎癥。突變小鼠總體白細(xì)胞計(jì)數(shù)僅輕度升高，但中性粒細(xì)胞和血小板增多是明顯的。在 CAPS 患者中一致描述了類似的血液學(xué)和皮膚檢查結(jié)果。來(lái)自Nlrp3 A350V/+ / CreL幼崽的發(fā)炎皮膚切片進(jìn)行了 IL-1β 和 IL-6 的免疫組織化學(xué)。兩種細(xì)胞因子（主要在真皮中的 IL-1β 和表皮中的 IL-6）的表達(dá)增加，與來(lái)自 CAPS 患者的皮膚活檢一致，并暗示這些細(xì)胞因子在皮膚病理學(xué)中的作用。TNFα 沒有顯著差異，這與先前描述的 CAPS 患者一致。
 

圖5. Nlrp3 點(diǎn)突變小鼠血清和皮膚中多種細(xì)胞因子上調(diào)[3]

2. 敲除小鼠模型
通過(guò)ES打靶技術(shù)生成Nlrp3 （Cias1)敲除小鼠模型，通過(guò)在ATG起始位置處插入EGFP達(dá)到敲除的目的：
 

圖6. Nlrp3基因敲除小鼠打靶策略[5]

野生型、Nlrp3+/-和Nlrp3-/-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的 pro-IL-1β，然而，與它們的野生型對(duì)應(yīng)物不同，Nlrp3-/-巨噬細(xì)胞在 ATP 處理后沒有切割 pro-IL-1β，表明，cryopyrin 對(duì)于 ATP 誘導(dǎo)的 caspase-1 激活至關(guān)重要；用 LPS或 Pam3CSK4 引發(fā)的野生型巨噬細(xì)胞響應(yīng)尼日利亞菌素或 maitotoxin分泌IL-1β和IL-18，相比之下，Asc-/-和Nlrp3-/-巨噬細(xì)胞均未釋放顯著的IL-1β或IL-18。

CAPS的治療
在大多數(shù)情況下，CAPS 由NLRP3基因突變引起。改變的基因產(chǎn)物cryopyrin激活炎癥小體，導(dǎo)致IL-1β的過(guò)度產(chǎn)生。IL-1β 導(dǎo)致 CAPS 的炎癥表現(xiàn)。IL-1 抑制劑是安全有效的治療選擇，隨著 IL-1 抑制劑的出現(xiàn)，為這種破壞性疾病提供了安全有效的治療選擇。

非甾體抗炎藥常用于緩解關(guān)節(jié)疼痛。高劑量的皮質(zhì)類固醇已被證明在一定程度上有效，但可能會(huì)引起短期和長(zhǎng)期的副作用。

Regeneron Pharmaceuticals 的 Arcalyst (Rilonacept) 是一種IL-1 阻滯劑，于 2008 年獲得 FDA 批準(zhǔn)用于治療成人和 12 歲及以上兒童的 CAPS，包括 FCAS 和 MWS。

諾華制藥的 Ilaris (Canakinumab)，一種針對(duì)IL-1β 的單克隆抗體。2009 年被 FDA 批準(zhǔn)用于治療患有 CAPS 的兒童和成人，包括 FCAS 和 MWS。

Biovitrum Pharmaceuticals 的 Kineret (Anakinra) 是一種 IL-1 受體拮抗劑，已廣泛用于 FCAS 患者，臨床效果極佳。然而，它目前未被 FDA 批準(zhǔn)用于治療 FCAS 或任何 CAPS 疾病。

小結(jié)
未來(lái)的研究將需要解決cryopyrin中的激活突變?nèi)绾我?guī)避炎癥小體的正常調(diào)節(jié)以產(chǎn)生炎癥性疾病，如家族性感冒自身炎癥綜合征、Muckle-Wells綜合征和新生兒多系統(tǒng)炎癥性疾病。一個(gè)有趣的可能性是低水平的細(xì)菌感染加上失調(diào)的冷熱蛋白反應(yīng)會(huì)引發(fā)與這些疾病相關(guān)的癥狀。

參考文獻(xiàn)：
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