CRISPR-Cas9技術(shù)在實現(xiàn)內(nèi)源性基因替換治療β-地貧小鼠模型上的應(yīng)用

2020年，CRISPR/Cas9技術(shù)成功摘下諾獎桂冠，成為當(dāng)下最熱門的基因編輯技術(shù)。CRISPR/Cas9在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有強(qiáng)大的潛力，已經(jīng)在多種基因疾病上顯示出強(qiáng)大的治療效果。

2021年3月，Integrated DNA Technologies(埃德特生物，以下簡稱IDT)聯(lián)合美國斯坦福大學(xué)、貝勒醫(yī)學(xué)院等全球知名機(jī)構(gòu)的研究人員在國際頂級學(xué)術(shù)期刊Nature Medicine（影響因子：36.130）發(fā)表重磅研究論文，利用IDT公司的Alt-R® CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)和Lonza的電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，成功在小鼠模型中實現(xiàn)用β-珠蛋白替代α-珠蛋白來治療β-地中海貧血。

在這項研究中，研究人員使用LONZA 4D-Nucleofector對β-地貧來源CD34+ HSPC進(jìn)行電穿孔，然后利用AAV6作為載體將IDT公司的Cas9結(jié)合化學(xué)合成的sgRNA遞送至HSPC進(jìn)行基因編輯，在保持高度同源HBA2基因的同時，將內(nèi)源性HBA1基因敲除并替換成全長HBB基因。

研究結(jié)果顯示：該基因編輯策略使得β-球蛋白：α-球蛋白信使RNA和蛋白質(zhì)比率正�；�，能夠產(chǎn)生功能性的成年血紅蛋白四聚體；在小鼠模型體內(nèi)回輸后，經(jīng)過基因編輯的HSPC能夠在小鼠中進(jìn)行長期和雙系造血重建。提示HBB替代HBA1可以作為治療β-地中海貧血的新型治療策略。

 
研究人員表示，這項研究可能是首次證明在Cas9介導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂（DSB）下，能夠?qū)崿F(xiàn)整個內(nèi)源性基因替換。該發(fā)現(xiàn)有望能夠拓展CRISPR/Cas9的應(yīng)用范疇，以治療更多基因突變導(dǎo)致的疾病類型。
 

突破傳統(tǒng)CRISPR/Cas9的局限性
 
近年來，CRISPR基因編輯技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域，可以預(yù)見的是基于CRISPR的基因組編輯技術(shù)轉(zhuǎn)化為醫(yī)學(xué)應(yīng)用會對人類健康產(chǎn)生重大影響，而此技術(shù)也引領(lǐng)了分子生物學(xué)工具的一場革命。
 
但是CRISPR/Cas9目前仍然存在一些局限性，限制了CRISPR/Cas9的快速發(fā)展，例如脫靶效應(yīng)。同時，傳統(tǒng)CRISPR/Cas技術(shù)在基因切割上具有強(qiáng)大的優(yōu)勢，但是在長片段DNA精確的靶向插入/替換上依然存在一定的挑戰(zhàn)。
 
為了克服這些問題，IDT公司開發(fā)了Alt-R® CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，在降低整體脫靶率的同時實現(xiàn)在目標(biāo)靶點的高效切割。同時在最新發(fā)表的研究中，顯示出這種新型的CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠?qū)㈤L片段的功能性基因插入/替換致病性基因。
 
Alt-R® CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)主要采用遞送核糖蛋白復(fù)合物(Ribonucleoprotein complex，RNP)的方法，RNP即Cas9蛋白和gRNA結(jié)合形成的具有編輯功能的復(fù)合物。與傳統(tǒng)CRISPR/Cas9不同的是，在IDT公司Alt-R®CRISPR 系統(tǒng)中，gRNA的組成成分crRNA和tracrRNA均經(jīng)過優(yōu)化。
 
事實上，在2018年發(fā)表于期刊Nature Medicine上的另一篇研究文獻(xiàn)中，證實了Alt-R® CRISPR/Cas9的優(yōu)越性能。在該研究中，IDT公司的 Alt-R® S.P. HiFi Cas9呈現(xiàn)出穩(wěn)定的中靶編輯活性，脫靶率極低。

研究顯示：HiFi Cas9/AAV6能夠在5個治療位點（HBB、IL2RG、CCR5、HEXB、TRAC）誘導(dǎo)強(qiáng)大的基因編輯，具有高靶向性；同時HiFi Cas9/AAV6介導(dǎo)鐮狀細(xì)胞疾�。⊿CD）患者HSPC中p.E6V突變的高水平校正。
通過化學(xué)合成的高度定制化的引導(dǎo)RNA（gRNA）序列，配套使用的電轉(zhuǎn)/敲入增強(qiáng)子，各類對照試劑以及免費使用的序列設(shè)計工具，實現(xiàn)了從實驗設(shè)計到結(jié)果分析的全流程覆蓋，實現(xiàn)高效精準(zhǔn)的基因編輯，讓實驗不再困難。 
 

Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT) 是丹納赫集團(tuán)（Danaher Corporation，紐約證交所代碼：DHR）生命科學(xué)平臺旗下的一家運營公司。IDT致力于面向生命科學(xué)界開發(fā)、生產(chǎn)并銷售核酸產(chǎn)品，為學(xué)術(shù)與商業(yè)研究、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域提供支持。IDT 開發(fā)了多項針對基因組應(yīng)用的技術(shù)，涵蓋二代測序、CRISPR基因組編輯、合成生物學(xué)、數(shù)字PCR以及RNA干擾。通過GMP服務(wù)，IDT生產(chǎn)的產(chǎn)品被科學(xué)家用于研究多種形式的癌癥以及各類遺傳性和傳染性疾病，為超過130,000名生命科學(xué)研究人員提供服務(wù)，也是公認(rèn)的定制核酸生產(chǎn)行業(yè)的領(lǐng)導(dǎo)者。
 

Lonza公司的Nucleofector技術(shù)輕松實現(xiàn)CRISPR高效轉(zhuǎn)導(dǎo)
 
CRISPR技術(shù)作為除ZFN和TALEN技術(shù)外另一種有效的位點特異性基因組修飾的工具。而如何將CRISPR系統(tǒng)高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)到目的細(xì)胞中，成了另一個亟待解決的問題。Lonza獨有的Nucleofector技術(shù)已有20年的歷史，自2001年問世以來得到廣泛的客戶認(rèn)可，已經(jīng)被證明可作為基于CRISPR的基因組編輯工具的有效非病毒轉(zhuǎn)染方式。Nucleofector技術(shù)使用預(yù)優(yōu)化的電轉(zhuǎn)參數(shù)和細(xì)胞類型特異性電轉(zhuǎn)液的組合，以使得底物能夠直接轉(zhuǎn)染到細(xì)胞核中。與傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)相比，直接轉(zhuǎn)染到細(xì)胞核中，與細(xì)胞分裂無關(guān)，即使在非分裂的原代細(xì)胞中也具有較高的轉(zhuǎn)染效率。Nucleofector技術(shù)按照模塊化將小體積轉(zhuǎn)染及大體積轉(zhuǎn)染，可以實現(xiàn)在小體積到大體積的線性放大，適用于從藥物研發(fā)階段到臨床階段的轉(zhuǎn)化。