外泌體的介紹和檢測(cè)提取機(jī)制

近幾年，外泌體越來越多的被提起，CNS 里常常有它，自然基金課題總有它，Pubmed 里的文章數(shù)量呈現(xiàn)暴風(fēng)增長(zhǎng)，涉及癌癥、免疫、病毒感染、心血管疾病及神經(jīng)退行性疾病的全方位研究，甚至還有美容相關(guān)研究 。

 

想當(dāng)初，外泌體剛被發(fā)現(xiàn)的時(shí)候，還被貼上了“代謝廢物”的標(biāo)簽，如今卻搖身一變成了科研寵兒！妥妥的拿著“廢柴逆天”主角劇本。
 
 
 
外泌體 (Exosome) 是什么？
 
 
 

所有原核和真核細(xì)胞在生理正常或異常時(shí)，均可通過出芽的方式釋放各種各樣的膜包裹的囊泡 (Extracellular vesicles, EVs) 到胞外環(huán)境中，如外泌體、微囊泡、凋亡小體。胞外囊泡可廣泛的分為兩類，核外顆粒體 (Ectosome) 和外泌體。核外顆粒體是從質(zhì)膜脫離的外出芽小泡，包括直徑在 ~50 nm-1 μm 的微泡、微粒和大囊泡。

外泌體是細(xì)胞核內(nèi)體途徑起源的、直徑在 ~40-160 nm (平均 100 nm) 的囊泡。外泌體的產(chǎn)生涉及到一個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)過程，這可能決定了它們的組成，從而決定了它們的功能。
 

圖 1. 外泌體結(jié)構(gòu)和內(nèi)容物

 

 
 
外泌體的產(chǎn)生和分泌
 
 
外泌體的產(chǎn)生涉及質(zhì)膜的雙重內(nèi)陷、和含有腔內(nèi)小泡 (Intraluminal vesicles, ILVs)、細(xì)胞內(nèi)多囊泡體 (Multivesicular bodies, MVBs) 的形成。ILVs 通過 MVBs 與質(zhì)膜的融合和胞吐，最終以外泌體的形式分泌到胞外。
質(zhì)膜的第一次內(nèi)陷形成一個(gè)杯狀結(jié)構(gòu)，其中包含細(xì)胞表面的蛋白與胞外一些可溶性蛋白，這個(gè)過程形成了早期內(nèi)涵體 (Early-sorting endosome, ESE)。ESEs 可發(fā)展為成熟的晚期內(nèi)涵體 (Late-sorting endosomes, LSEs)，并最終生成 MVBs。MVBs 是通過質(zhì)膜雙凹形成的，這一過程導(dǎo)致 MVBs 含有多個(gè) ILVs (未來的外泌體)。MVBs 可以與溶酶體或自噬體融合被降解，或與質(zhì)膜融合以釋放所含的 ILVs 為外泌體。

 

圖 2. 外泌體的生成、分泌和分類

 

外泌體的起源和形成方式導(dǎo)致其內(nèi)容物、形狀、大小均有差異，從而會(huì)影響受體細(xì)胞的不同功能，這種特性被稱為外泌體的異質(zhì)性。外泌體可通過其大小和表面特異性標(biāo)記被識(shí)別，包括 TSG101、Alix、Flotillin-1、CD63、CD9 等。

 

 
外泌體分泌途徑的分子機(jī)制
 
 
 

■ ESCRT

 

說起分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)，不得不提轉(zhuǎn)運(yùn)所需的內(nèi)涵體分選復(fù)合體 (Endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)。ESCRT 是一個(gè)蛋白家族，在 MVBs 膜上連續(xù)結(jié)合復(fù)合物 (ESCRT-0, -I, -II 和 -III)，其中 ESCRT-0 通過泛素化依賴途徑調(diào)控內(nèi)容物聚集，ESCRT-I 和 ESCRT-II 誘導(dǎo)芽的形成，ESCRT-III 驅(qū)動(dòng)小泡的脫落，而輔助蛋白 (特別是 VPS4 ATPase) 允許 ESCRT 系統(tǒng)的解離和循環(huán)。

 

ESCRT-0：ESCRT-0 復(fù)合體 (HRS 和 STAM) 不參與出芽和膜分離的過程，因此可作為追蹤外泌體來源的依據(jù)。HRS (Hepatocyte growth factor-associated tyrosine kinase) 識(shí)別單泛素化的蛋白，并與泛素化部分結(jié)合將蛋白靶向到  ILVs 上 (蛋白分選到 ILVs 中的過程主要取決于泛素化)，并與 STAM、Eps15 和 Clathrin 形成復(fù)合體。隨后 HRS 招募腫瘤易感基因 TSG101 (ESCRT-I 的組分)，ESCRT-0 和 ESCRT-I 一起負(fù)責(zé)泛素化蛋白的分選。

 

ESCRT-II ：ESCRT-II 是一個(gè)異四聚體的蛋白復(fù)合物，由 Vps36、Vps22 和雙拷貝的 Vps25 組成。Vps36 的 N 末端可與泛素 (內(nèi)容物蛋白或其它 ESCRT 上蛋白)、以及 ESCRT-I 的 C 末端結(jié)合。ESCRT-I/II 的超復(fù)合體被證明在 ILVs 的膜變形中發(fā)揮重要作用。然后，ESCRT-II 的 Vps25 亞基和 ESCRT-III 的 Vps20 亞基結(jié)合，啟動(dòng) ESCRT-III 工作。

 

圖 3. 外泌體的生物合成 (相關(guān)分子)

 

ESCRT-III：以酵母為例，ESCRT-III 由 Vps20、Snf7 (Vps32)、Vps24 和 Vps2 四個(gè)核心亞基、以及輔助蛋白 Did2、Vps60、和 Ist1 組成，在細(xì)胞質(zhì)中，這些亞基都是不活躍的單體，一旦結(jié)合膜上，它們形成一個(gè)瞬態(tài)的 ESCRT-III 異聚合物。前面說到 ESCRT-II 的 Vps25 亞基和 ESCRT-III 的 Vps20 亞基結(jié)合， 然后 Snf7 被 Vps24 和 Vps2 包裹 (像帽子蓋住)，與 Vps20 形成復(fù)合體。ESCRT-III 促進(jìn)膜分離，促使囊泡斷離。

 

■ Rab GTPases

 

Rab 家族的小 GTPases 成員在細(xì)胞內(nèi) ILVs 的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了明確的作用，也參與了 MVBs 與質(zhì)膜的對(duì)接、以及外泌體的釋放。其中 Rab27a 和 Rab27b 作用于 MVBs (也叫 MVE，Multivesicular endosomes) 與質(zhì)膜的對(duì)接。Rab27a 抑制后，MVBs 的大小顯著增加，而抑制 Rab27b 后導(dǎo)致 MVBs 的向核周圍區(qū)域的重新分布，此外，Rab27 兩個(gè)效應(yīng)因子 Slp4 (SYTL4) 和 Slac2b (EXPH5) 被抑制后同樣抑制外泌體的分泌且分別導(dǎo)致 Rab27a 和 Rab27b 的沉默。

 

■ SNAREs

 
研究外泌體生物發(fā)生的一個(gè)主要目標(biāo)是識(shí)別 MVBs 與質(zhì)膜融合所需要的 SNARE (可溶性 N-乙基馬來酰亞胺敏感融合連接蛋白受體) 復(fù)合物。YKT6 SNARE 被證明是分泌含 Wnt 的外泌體所必需的，而 Syx-5 (線蟲同源物 Syntaxin-5)，通過 Ral-1 小 GTPase 使 MVBs 靶向質(zhì)膜。另外，Syntaxin-1A 是神經(jīng)元特異性的 SNARE，參與突觸囊泡的分泌，能影響果蠅的外泌體分泌。
 

■ 其它

 
ARF6 是 ILVs 出芽和外泌體生物合成的調(diào)節(jié)因子，該調(diào)節(jié)作用依賴于 ARF6 的效應(yīng)器 PLD2。
Doa4 N 末端具有一個(gè)相當(dāng)于 MIT 結(jié)構(gòu)域的 α 螺旋結(jié)構(gòu)，直接與 ESCRT-III 的 Vsp20 亞基中類似 MIM1 的序列結(jié)合，可促進(jìn) ILVs 的形成。
 

外泌體被生產(chǎn)出來后去哪里了呢？小編告訴你，它們可能被別的細(xì)胞“吃了”！

 
 
 
外泌體的攝取
 
 
 

目前還不清楚外泌體是否必須被免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞內(nèi)化以引起細(xì)胞反應(yīng)。根據(jù)現(xiàn)有研究，外泌體被攝取內(nèi)化的途徑主要有以下幾種。

 

圖 4. 外泌體的攝取途徑
 
 

◎ 可溶性信號(hào)通路：對(duì)外泌體表面的配體進(jìn)行蛋白水解切割或選擇性剪接。比如：膜結(jié)合的 FasL、TRAIL 和 TNF 可以被金屬蛋白酶切割，形成可溶性細(xì)胞因子。

◎ 近分泌信號(hào)通路：外泌體和靶細(xì)胞表面的配體和受體鄰近，通過信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮作用。比如：培養(yǎng)的胎盤外植體或孕婦血漿中的外泌體膜上具有 FasL 和 TRAIL，并通過 NF-κB、CD3ζ 和 JAK3 的下調(diào)，來誘導(dǎo) Jurkat T 細(xì)胞凋亡。

 

◎ 融合：例如，研究證實(shí)單核細(xì)胞來源的微泡可以與活化的血小板的質(zhì)膜融合，并將蛋白轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，如組織因子和 P-選擇素糖蛋白配體-1 (PSGL-1)。

 

◎ 吞噬作用：吞噬是一種肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的機(jī)制，需要特定的調(diào)理素蛋白受體 (如 FcR 和補(bǔ)體受體)、清道夫受體或 Toll 樣受體的參與�？捎删奘杉�(xì)胞和樹突狀細(xì)胞這類“專業(yè)細(xì)胞”完成，也可由 γδT 等“非專業(yè)”細(xì)胞完成。例如，單核/巨噬細(xì)胞能夠更有效地吞噬內(nèi)化來自紅血球 (K562) 和 T 細(xì)胞白血病 (MT4) 細(xì)胞的外泌體。外泌體的吞噬作用依賴于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、磷脂酰肌醇 3 激酶 (PI3K) 和 Dynamin2。

 

◎ 巨胞飲：少突細(xì)胞來源的外泌體表面的磷脂酰絲氨酸 (PtdSer) 激活了不具備抗原呈遞能力的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞亞群的大胞吞。外泌體的巨胞飲作用依賴于 Na⁺ 和 PI3K，EIPA 和 LY294002 分別抑制 Na⁺-H⁺ 離子交換和 PI3K 活性，減少外泌體攝取。

 

◎ 受體和脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞：這兩個(gè)途徑需要外泌體表面的配體與質(zhì)膜上的特定受體結(jié)合，在細(xì)胞質(zhì)膜上分別需要存在富含膽固醇和鞘脂的微區(qū)。前者也稱為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。后者包括小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，以及 RhoA-、CDC42-和 ARF6-調(diào)控的、獨(dú)立于網(wǎng)格蛋白和小窩的內(nèi)吞作用，它們利用 Dynamin、Flotillin 和/或 Rab 蛋白的不同組合。如大鼠腎上腺髓質(zhì) (PC12) 腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體可通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用部分內(nèi)化。

 

 

參考文獻(xiàn) 

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