微流控毛細管電泳法在藥物研發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)控上的應用優(yōu)勢舉例

抗體藥物的研發(fā)和生產(chǎn)過程非常復雜，有諸多技術瓶頸，如全人源抗體篩選核心技術平臺的建立和制備、高表達細胞系的構建、細胞培養(yǎng)與蛋白純化工藝步驟及過程對產(chǎn)品純度和各項理化特性的影響等。因此，無論是FDA提出的質(zhì)量源于設計（QbD）原則，還是我國的《生物類似藥研發(fā)與評價技術指導原則》，都對生物大分子藥物的工藝開發(fā)提出了更高的要求�，F(xiàn)在QbD理念已經(jīng)普遍被國內(nèi)外藥物研發(fā)企業(yè)認可和推崇，它強調(diào)需要確定并理解影響蛋白藥物療效的關鍵質(zhì)量屬性（CQA）。嚴格地監(jiān)督和控制這些屬性，有助于確保穩(wěn)定的、更加可預測的研發(fā)和工藝流程。

針對生物大分子藥物研發(fā)和生產(chǎn)過程的篩選與質(zhì)控，基于微流控技術的LabChip^® GXII Touch能夠對細胞培養(yǎng)液上清及純化后的抗體、融合蛋白的滴度、純度、糖基化程度、片段化及聚合、糖譜、電荷異質(zhì)性等關鍵質(zhì)量屬性進行快速、準確、可重復、自動化的定性定量分析，以及克隆構建過程中的DNA、RNA分析。每個樣品的分析時間耗時少至42秒，提供可以媲美傳統(tǒng)毛細管電泳的數(shù)據(jù)同時，通量增加70倍。

01 純度檢測

目前，監(jiān)測蛋白質(zhì)產(chǎn)品質(zhì)量的方法包括SDS-PAGE、毛細管電泳（CE）和HPLC。SDS-PAGE勞動強度大，且難以實現(xiàn)自動化，在現(xiàn)代分析實驗室中已被基于CE的分析方法代替。CE和HPLC分析需要15-60分鐘/樣品分離時間，一定程度上限制了DOE研究。在過去的十幾年中，基于微流控的檢測方法廣泛應用于蛋白質(zhì)的大小測定、定量和純度評估，因為它有效解決了SDS-PAGE、HPLC和CE方法的局限性。

圖1：Micochip與傳統(tǒng)CE-SDS方法的比較。還原單抗樣品同時利用 (A) LabChip^® 90和 (B) Proteomelab PA800進行分析

美國Amgen公司分析與制劑科學部門2008年在Electrophoresis雜志上發(fā)表的文章中^[1]，對使用LabChip技術篩選mAb產(chǎn)品質(zhì)量屬性進行了研究。他們在還原和非還原條件下分析了來自CHO細胞培養(yǎng)上清粗提液的mAb和純化產(chǎn)物，所得分辨率和靈敏度與傳統(tǒng)CE-SDS相似，但分析速率要快大約70倍（42秒 vs 50分鐘/樣品，如圖1）。Amgen研發(fā)人員在該文章中使用HT Protein Express  assay對粗提樣品中的非糖基化重鏈（NGHC）進行定量分析，以測定高甘露糖的相對含量。他們最終得出結論，該實驗可為早期細胞培養(yǎng)篩選提供有價值的反饋。

微流控毛細管電泳方法用于單抗藥物生產(chǎn)質(zhì)控和放行分析

美國GSK公司生物制藥分析科學部門2017年在Electrophoresis雜志上發(fā)表的文章中指出^[2]，他們已經(jīng)成功將微流控毛細管電泳檢測方法貫穿應用在整個單克隆抗體產(chǎn)品開發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)控流程中，包括前期研發(fā)以及后期cGMP（現(xiàn)行藥品生產(chǎn)管理規(guī)范）放行和穩(wěn)定性測試。整個實驗測試是在LabChip^® GXII Touch系統(tǒng)上采用HT Protein Express assay檢測完成。

LabChip^® GXII Touch系統(tǒng)檢測mAb樣本的還原以及非還原結果均符合DOE系統(tǒng)適應性以及樣本驗收標準，典型圖譜如圖2a和2b所示。

圖2a.還原樣品電泳圖-mAB1  圖2b.非還原樣品電泳圖-mAB1

高分辨率蛋白純度分析——進一步滿足生產(chǎn)質(zhì)控的高要求

基于LabChip^® GXII Touch微流控平臺的Protein Clear HR assay是專為mAb研發(fā)和生產(chǎn)過程中的高分辨率蛋白純度分析而設計開發(fā)的，能夠可視化地檢測樣品中低至5ng/μL的雜質(zhì)。它在Protein Express assay的基礎上，更加提升性能，使得樣本純度分析的重復性更上一層樓，可以進一步滿足生產(chǎn)質(zhì)控的高要求。利用LabChip^® GXII Touch系統(tǒng)的分析能力和速度，以及IntelliChip的實驗參數(shù)自動反饋優(yōu)化技術，您可以擁有無以倫比的通量和重現(xiàn)性，從而加速蛋白研發(fā)流程。

02 糖譜分析

糖基化等轉錄后修飾對于蛋白質(zhì)功能有很重要的作用，它會影響治療性抗體的藥代動力學、藥效以及安全性等。抗體生產(chǎn)過程中培養(yǎng)基、pH值、溫度等條件的變化都會影響糖基化的結構。因此，各家藥物生產(chǎn)商必須在研發(fā)和生產(chǎn)中不斷對糖型進行檢測分析。如果用傳統(tǒng)的HPLC，CE-LIF技術或者質(zhì)譜技術來分析N-糖型，通常需要2-3天的時間來進行消化、標記和分析，而利用一體式的標準Profiler Pro Glycan試劑盒，在LabChip^® GXII Touch上實現(xiàn)高分辨率的分離檢測，96個樣品可以在不到6個小時之內(nèi)完成。每個樣品檢測可在45秒內(nèi)完成，且只需要8μL樣品。同時LabChip芯片和試劑盒適用于多次檢測，單次芯片制備最多可運行192個樣品。

圖3. 糖譜分析圖

03 電荷異質(zhì)性分析

LabChip^® GXII Touch技術可用于鑒定相對于mAb主峰的堿性和酸性變體，其結果生成速度比常規(guī)IEX（離子交換色譜）和CZE（毛細管區(qū)帶電泳）快15倍，且能夠自動計算變體的相對百分比。更大的通量意味著您可優(yōu)化使用寶貴的研究時間，使藥物更快進入到臨床。

圖4. LabChip^® GXII Touch荷電異質(zhì)實驗（左圖）與傳統(tǒng)CZE實驗（右圖）的比較。堿性區(qū)的遷移快于主峰，而酸性區(qū)遷移則較慢。用戶可使用系統(tǒng)軟件工具“Expected Peak”命名各樣品峰，各變體的相對百分含量自動以表格形式顯示。

LabChip^® GXII Touch系統(tǒng)能快速分析蛋白樣品的純度、滴度、糖基化程度、糖譜分析、電荷異質(zhì)性等多項關鍵質(zhì)量屬性，為生物治療藥物研發(fā)和生產(chǎn)流程的各個環(huán)節(jié)提供快速分析和樣品質(zhì)控。同時也該系統(tǒng)可以對DNA、RNA、Small RNA等核酸樣品進行片段分析及質(zhì)控。

除了微流控平臺外，我們還可以利用多模式平臺，結合靈活、靈敏的HTRF和ALPHA等技術，針對抗體生產(chǎn)的原材料制備、轉染和抗體生產(chǎn)等多個環(huán)節(jié)提供高通量的質(zhì)控解決方案。例如，靶向抗體的穩(wěn)定性和聚集性檢測，我們一方面可以通過直接檢測抗體的自發(fā)熒光變化，研究尿素誘發(fā)的抗體變性過程^[3]，我們也可以利用ALPHA技術，配合抗熱的、特異識別構象表位的納米抗體開展抗體/蛋白復合物的熱穩(wěn)定性研究^[4]。針對CHO等工具細胞株的一些重要污染指標，如dsRNA和HCP殘留等，我們則提供商業(yè)化的成熟解決方案^[5，6]