淀粉樣蛋白沉積和致病標(biāo)志物周圍細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)失調(diào)的揭示

近日，Cell 在線發(fā)表的論文 “Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer’s Disease” 中，研究團(tuán)隊(duì)在 AD 小鼠模型中，利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究淀粉樣斑塊周圍直徑 100 μm 的組織結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄變化，證明了豐富的髓鞘和少突膠質(zhì)細(xì)胞基因 (OLIGs) 的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的早期改變，而斑塊誘導(dǎo)基因 (PIGs) 的多細(xì)胞基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)涉及補(bǔ)體系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、溶酶體和炎癥，在疾病的后期表現(xiàn)突出。研究人員通過對(duì)小鼠和人腦切片的原位測(cè)序，證實(shí)了細(xì)胞水平上觀察到的大部分變化。全基因組空間轉(zhuǎn)錄組分析提供了一個(gè)新的方法，以揭示 AD (淀粉樣蛋白沉積) 和其他腦疾病的致病標(biāo)志物周圍的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)失調(diào)。

 
研究背景
 

淀粉樣斑塊與神經(jīng)變性過程的關(guān)系是 AD 研究中的一個(gè)核心問題。自從“淀粉樣蛋白沉積”的病理現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)后，一個(gè)世紀(jì)以來，科學(xué)界展開了大量的研究，直到現(xiàn)在這種現(xiàn)象與 AD 疾病發(fā)展之間的關(guān)系仍未明了。已知：

 

1、淀粉樣斑塊可能起 AD 的觸發(fā)或驅(qū)動(dòng)作用。

 

2、散發(fā)性 AD 的風(fēng)險(xiǎn)與小膠質(zhì)細(xì)胞中響應(yīng)淀粉樣蛋白沉積的基因表達(dá)相關(guān)，星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞也表現(xiàn)出對(duì)淀粉樣斑塊的分子反應(yīng)。

 

3、在 AD 中，將神經(jīng)元、各種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分離再檢測(cè)胞質(zhì) mRNA 結(jié)果并不理想，還可能人為的影響表達(dá)圖譜，導(dǎo)致大多數(shù)空間信息的丟失，包括細(xì)胞和淀粉樣斑塊的關(guān)系�？臻g條形碼陣列 (Spatially barcoded arrays) 支持進(jìn)行組織中無偏倚的轉(zhuǎn)錄組分析，維持已測(cè)序分子的空間定位。

 

Bart De Strooper 和 Mark Fiers 研究團(tuán)隊(duì)通過一種開創(chuàng)性技術(shù)來具體研究斑塊附近的腦細(xì)胞中發(fā)生的變化。

 

圖 1. 研究概要圖

 
文章概要
 

在小鼠和人腦樣本中，該研究結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組法和原位測(cè)序的實(shí)驗(yàn)方法，顯示了 AD 中的多細(xì)胞基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。研究團(tuán)隊(duì)鑒定了兩個(gè)由淀粉樣斑塊沉積誘導(dǎo)表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，一個(gè)是斑塊誘導(dǎo)基因 (PIG) 網(wǎng)絡(luò)，主要涉及小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞；另一個(gè)是少突膠質(zhì)細(xì)胞基因 (OLIG) 和髓鞘反應(yīng)。

 
主要研究方法
 

空間轉(zhuǎn)錄組方法 (ST)

正交原位測(cè)序方法 (ISS)

RNAscope 原位雜交技術(shù)

免疫熒光檢測(cè)技術(shù)

 
小鼠模型
 

 

App^NL-G-F小鼠 (AD 小鼠模型，App gene：淀粉樣前蛋白基因)

C57BL/6 小鼠

 

研究結(jié)果
 

研究團(tuán)隊(duì)對(duì) AD 小鼠的 10,327 個(gè)組織域 (TD) 空間轉(zhuǎn)錄組 (ST) 圖譜根據(jù)大腦區(qū)域進(jìn)行聚類，并通過 WGCNA (基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，基于具有相似表達(dá)模式的基因可能具有相似的功能) 劃分模塊。作者重點(diǎn)介紹了對(duì) β-淀粉樣蛋白 (Aβ) 高度敏感的兩個(gè) WGCNA 模塊：PIGs 和 OLIGs。

 

圖 2. Gene Ontology 分析和 WGCNA 分析

(purple: PIGs; red: OLIGs)

 

■ PIG 模塊

 

斑塊誘導(dǎo)基因 (Plaque-induced gene, PIG) 主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，體現(xiàn)了它們之間的細(xì)胞間串?dāng)_，并涉及其他細(xì)胞。這種相互作用使經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)和內(nèi)體/溶酶體途徑伴隨著改變。

 
為了了解基因表達(dá)的變化，研究人員進(jìn)行了兩次差異表達(dá)分析。第一次比較 App^NL-G-F 小鼠與 C57BL/6 小鼠 (基因型模型，基因型軸)，第二個(gè)研究 Aβ 沉積對(duì)基因表達(dá)的影響 (Aβ 模型，Aβ 軸) 。
 
在 App 敲入的 AD 小鼠模型中，淀粉樣蛋白斑塊微環(huán)境中逐步建立一種多細(xì)胞共同表達(dá)的基因反應(yīng)。其中包括 57 個(gè) PIGs，在 Aβ 軸和基因型軸在晚期 (18 個(gè)月大小鼠) 反應(yīng)最為活躍，這些基因在早期 (3 個(gè)月) 只是輕微上調(diào)，經(jīng)歷一個(gè)急劇上升到晚期穩(wěn)定的過程。因此，PIG 的表達(dá)隨著在整個(gè)腦區(qū)域中 Aβ 的積累而逐漸增加。
 
該模塊中涉及了經(jīng)典補(bǔ)體級(jí)聯(lián) (如 C1qa，C1qb，C1qc 等)，還有補(bǔ)體級(jí)聯(lián)所觸發(fā)的效應(yīng)機(jī)制，如內(nèi)吞作用 (如 Fcer1g，Fcgr3，B2m 等)，溶酶體降解 (如 Hexa，Hexb，Ctsa  等) ，抗原加工提呈、免疫應(yīng)答和氧化還原過程。此外，PIG 模塊的細(xì)胞標(biāo)志與激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞有很高的重疊性。
 

圖 3. PIG 與 ARM/DAM 
小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞部分重疊 
(DAM：疾病相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞；
ARM：激活反應(yīng)的小膠質(zhì)細(xì)胞)
 

其他實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充：ST 結(jié)果顯示了淀粉樣斑塊周圍有多細(xì)胞反應(yīng)，但 ST 技術(shù)無法達(dá)到單細(xì)胞水平，因此研究團(tuán)隊(duì)還通過 ISS 在單細(xì)胞水平上作為對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行補(bǔ)充，ISS 的結(jié)果與 ST 的結(jié)果具有很好的相關(guān)性。PIG 網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞標(biāo)志顯示，PIG 對(duì) Aβ 的反應(yīng)在很大程度上是由小膠質(zhì)細(xì)胞引起的，在較小程度上由星形膠質(zhì)細(xì)胞引起的。利用 RNAscope 原位雜交驗(yàn)證了補(bǔ)體組分 (C1qa，C4 和 Clu) 在晚期 AD 小鼠模型中的表達(dá)，這 3 個(gè)補(bǔ)體組分的細(xì)胞標(biāo)志與 ISS 分析一致。

 

圖 4. 隨著 Aβ 沉積逐步建立的 PIGs 的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

 

PIGs 中小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞基因的共表達(dá)：根據(jù) Aβ 沉積水平將所有 ST TD 分為 WT 和 AD 的四個(gè)等級(jí)，WGCNA 生成一個(gè)指示基因之間相關(guān)性的共表達(dá)通用矩陣，隨著 Aβ 積累的增加，基因聯(lián)系的“劑量”敏感性 (Dose-sensitive) 增加，顯示了表達(dá)網(wǎng)絡(luò)隨著 Aβ 暴露的增加而逐步建立。

 

■ OLIG 模塊

 

少突細(xì)胞基因 (oligodendrocyte gene, OLIG) 為髓鞘化相關(guān)基因，主要由少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。

 

WGCNA 第二個(gè)大的模塊由主要由少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的 165 個(gè)基因組成，被稱為 “OLIG 模塊”。實(shí)驗(yàn)證明，OLIG 模塊在中度 Aβ 暴露時(shí)高表達(dá)，但是在重度 Aβ 暴露的微環(huán)境中下降。因此，OLIG 模塊表達(dá)的大腦區(qū)域差異與 Aβ 表達(dá)程度相關(guān)。

 

圖 5. OLIG 模塊對(duì) Aβ 積累的響應(yīng)
(Oli0：人類 AD 相關(guān)的少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的小鼠直系同源物)

 

總的來說，該研究證實(shí)了 OLIGs 的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)在疾病早期改變，而 PIGs 的多細(xì)胞基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)涉及補(bǔ)體系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、溶酶體和炎癥，在疾病的后期表現(xiàn)突出。

 

■ 人腦中 PIG 和 OLIG 模塊的可視化

 

研究人員對(duì) AD 患者額上回組織樣本的 222 個(gè)基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，包括 PIGs 的 45 個(gè)人類同源序列表達(dá)，OLIG 模塊中 42 個(gè)斑塊反應(yīng)性基因同源序列的表達(dá)，以及一系列的細(xì)胞類型標(biāo)志，如預(yù)期一樣，PIG 模塊和 OLIG 模塊基因分別在灰質(zhì)和白質(zhì)中富集。使用同樣的 ISS 方法研究了 PIGs 在對(duì)照和 AD 腦中人類直系同源物的分布，證明了 AD 患者中與疾病相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)活化。
 

圖 6. 人腦中 PIG 和 OLIG 模塊的分析

 
結(jié)論：
 
實(shí)驗(yàn)技術(shù)：展示了最近開發(fā)的 ST 和 ISS 技術(shù)在腦疾病方面的應(yīng)用。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：數(shù)據(jù)表明，淀粉樣斑塊在疾病發(fā)展中“并非無辜”，實(shí)際上，它誘導(dǎo)了周圍所有細(xì)胞的強(qiáng)烈和協(xié)調(diào)的反應(yīng)。因此，還需要進(jìn)一步的工作來了解是否以及何時(shí)去除淀粉樣蛋白斑塊足以逆轉(zhuǎn)正在進(jìn)行的細(xì)胞過程。另外，抗體結(jié)合淀粉樣斑塊將調(diào)節(jié)這些膠質(zhì)反應(yīng)有待確定，這會(huì)使臨床試驗(yàn)的結(jié)果的解釋復(fù)雜化，因?yàn)榧?xì)胞效應(yīng)可能因抗體而異。

 

 

相關(guān)化合物庫	作用
神經(jīng)保護(hù)化合物庫	收錄了 400+ 種具有潛在神經(jīng)保護(hù)作用的化合物，這些化合物主要靶向神經(jīng)保護(hù)通路中的主要靶點(diǎn)，如鈣離子通道，鈉離子通道，腺苷 A1 受體等；是開發(fā)神經(jīng)保護(hù)藥物，研究神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的有效工具。
抗阿爾茨海默病化合物庫	收錄了 400+ 種具有抗阿爾茲海默病活性的化合物及靶向阿爾茲海默病主要靶點(diǎn)的化合物；是研究阿爾茲海默病發(fā)病機(jī)制及開發(fā)抗阿爾茲海默病藥物的有用工具。
神經(jīng)信號(hào)化合物庫	收錄了 1300+ 種神經(jīng)信號(hào)相關(guān)的小分子化合物，是研究神經(jīng)調(diào)控及神經(jīng)疾病的有用工具。
神經(jīng)遞質(zhì)受體化合物庫	提供 900+ 種神經(jīng)遞質(zhì)受體相關(guān)的化合物，可以用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物的篩選。
可透過中樞神經(jīng)系統(tǒng)化合物庫	收錄了 400+ 個(gè)具有明確報(bào)道可以透過血腦屏障的小分子化合物，是開發(fā)腦部疾病藥物如腦瘤、精神障礙和神經(jīng)退行性疾病等有效的工具。

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縮寫：

AD：Alzheimer’s disease
OLIGs ：Oligodendrocyte genes
PIGs：Plaque-induced genes
Aβ：Amyloid β-protein
ST ：Spatial transcriptomics
TDs ：Tissue domains
App：Amyloid precursor protein
ENTI：Entorhinal area
ISS ：In situ sequencing
DAM ：Disease-associated microglia
ARM：Activated response microglia
 
原文閱讀：Wei-Ting Chen, et al. Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer's Disease. Cell. 2020 Jul 17;S0092-8674(20)30815-1.