表觀遺傳：YTHDF蛋白調節(jié) m6A-RNA
與“不同的 m6A 位點結合不同的 DF 蛋白”的主流觀點不同，該研究人員發(fā)現，所有 m6A 位點與三個 DF 蛋白都以基本相似的方式結合，它們以冗余的作用方式誘導同一子集的 mRNA 降解，沒有證據表明它們能直接促進翻譯。
圖 1. YTHDF 蛋白調控 m6A 修飾的 mRNA 的功能模型
m6A (N6-methyladenosine)：是指腺嘌呤核苷 N6 位置發(fā)生了甲基化修飾。m6A 是真核 mRNA 最普遍的內部修飾，在功能上調節(jié)真核轉錄組，影響 mRNA 的剪接、輸出、定位、翻譯和穩(wěn)定性。
m6A 修飾有三類調節(jié)器：
Writer 甲基轉移酶 (MTC)，負責催化，例如 METTL3、METTL14 和 WTAP；
Eraser 去甲基化酶 (Demethylase)，負責去除甲基化，例如 FTO 和 ALKBH5；
Reader 直接識別和結合 m6A 位點，使 m6A 修飾的 RNA 發(fā)揮特定的作用，主要包括 YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3 等。
YTHDF：一種 m6A “閱讀器”，即 Reader。胞質中的 YTHDF 家族包括了 YTHDF1、YTHDF2 和 YTHDF3 三種旁系同源物 (paralogs)，也可以簡稱為 DF1、DF2、DF3。據報道，三種 DF 有不同的功能，DF1 促進 mRNA 的翻譯，DF2 促進 mRNA 的降解，DF3 促進翻譯和降解。
關于 DF 旁系同源物選擇性地結合不同的 m6A 位點的機制目前尚未清楚。此外，DF 蛋白功能差異的機制基礎也仍不清楚，尤其是在它們同源性很高的情況下。
圖 2. 研究亮點
首先，研究人員觀察 DF1 和 DF2 YTH 結構域與含有 m6A 的 RNA 的結合，發(fā)現在整個轉錄組中，DF 蛋白結合 m6A 的氨基酸以及結合近端的氨基酸都是保守的，因此三個 DF 蛋白與 m6A 結合的結構機制是相同的。
DF 旁系同源物結合 m6A 序列基序 (Sequence motifs) 的差異反映可以其結合特性，研究發(fā)現 m6A 殘基幾乎只存在 DR-m6A-CH (D = A, G, U; R = A, G; H = A, C, U) 這一個高度保守的序列基序中，像 GG-m6A-CU、AG-m6A-CU 都屬于 DR-m6A-CH 的亞基序 (Submotif) 。
為了確定每種 DF 的結合偏好，研究人員通過全轉錄組 iCLIP 圖譜，檢測了 HEK293T 細胞內源性表達的 DF1、DF2 和 DF3 的結合位點，分析發(fā)現三種 DF 結合位點序列亞基序的偏好相同。再結合已報道的 PAR-CLIP 數據，發(fā)現即使用不同的細胞系和不同的 CLIP 方法，DF 旁系同源物的 RNA 結合基本相同。因此， DF 旁系同源物的 m6A 結合模式相同。
圖 3. DF 蛋白與 m6A 結合位點的轉錄組分析
但是，不同的 DF 如何對 m6A-mRNAs 發(fā)揮不同的分子效應這個問題仍未解決，研究人員又分析了 DF 旁系同源物之間的效應區(qū)域差異，以及它們的相互作用蛋白 (不同的 DF 蛋白可能通過與不同的蛋白相互作用介導其不同的功能)。結果顯示，DF 旁系同源物的序列、功能域、相互作用蛋白和細胞內定位都高度相似。
此外，研究人員還發(fā)現 DF 蛋白與降解有關的因子相互作用可信度較高，與翻譯相關的因子相互作用可信度較低。
根據已有報道，研究人員考慮到每種 DF 蛋白都有介導 m6A-mRNA 降解的可能性。于是，他們利用 siRNA 選擇性敲降 HeLa 細胞中的 DF1、DF2 和 DF3，使用 RNA-seq 檢測 mRNA 的豐度，證實是 DF2 影響了 m6A-mRNA 穩(wěn)定性，而非 DF1 或 DF3。
圖 4. DF 蛋白冗余地控制 m6A-mRNA 的豐度和穩(wěn)定性
再對 DF 進行不同組合的雙重敲降和三重敲降，并利用放線菌素 D (Actinomycin D) 抑制轉錄后 m6A-mRNA 的水平證明了：DF 蛋白的聯合活性導致 m6A 修飾的 mRNA 降解，DF 旁系同源物在功能上可以互相補償，這種補償功能也受其表達水平限制。當三種 DF 都耗竭時，補償就不會發(fā)生，這時 m6A-mRNA 的穩(wěn)定性得到最大程度的提高。接下來，研究人員檢測了 DF 在 m6A-mRNA 的翻譯調控中的作用。三種 DF 都與多聚核糖體組分無關，而富集于信使核糖核蛋白 (mRNP) 組分，該結果與 “DF 蛋白(任何一種) 穩(wěn)定地結合至 mRNA 3'UTR，增強其翻譯的模型” 不一致。
任何的 DF 旁系同源物基因沉默都不影響 HeLa 細胞中 mRNA 的翻譯效率，即使是 DF 三重敲降也沒有顯著降低翻譯效率。因此，任何一種 DF 同源旁系物都不能直接增強 mRNA 的翻譯，相反的，它們的主要作用是介導 m6A-mRNA 降解。
圖 5. DF 蛋白冗余地抑制白血病細胞的分化
已有報道 DF2 在急性髓系白血病 (AML) 中過表達，與 AML 的發(fā)生和發(fā)展有關，DF2 的缺失導致一些抑制 AML 相關基因轉錄本上調，例如在 DF2 敲除的白血病前期細胞中，TNFRSF1B 轉錄本的半衰期增加，表面 TNFR2 的表達量上升。
為探索 TNFRSF1B 的抑制是否是通過三種 DF 蛋白共同作用介導，研究人員對 MOLM-13 白血病細胞中的 DF 進行單獨或聯合敲降，發(fā)現 TNFRSF1B mRNA 表達水平受 DF 的單獨敲降影響較小，其中僅 DF2 的敲降使其略微升高，在三重敲降后卻顯著上調。因此，在 MOLM-13 細胞中 DF 蛋白共同作用控制 m6A-mRNA 的表達水平。
| 相關抑制劑 | 作用 |
| SAH | 氨基酸衍生物和幾種代謝途徑中的調節(jié)劑。METTL3-METTL14 異二聚體復合物 (METTL3-14) 的抑制劑 |
| 3-Deazaadenosine | S-腺苷高半胱氨酸 (SAH) 水解酶抑制劑；通過抑制 SAH 水解來抑制 m6A 基團插入 mRNA 底物中 |
| IOX1 | 甲基轉移酶 ALKBH5 抑制劑 |
| FB23-2 | 有效、選擇性的 mRNA m6A 去甲基酶 FTO 抑制劑 |
| FG-2216/IOX3 | HIF-PHD 抑制劑；在體外對 FTO 有抑制作用 |
| Rhein | 可逆地與 FTO 催化結構域結合，并競爭性地阻止了對 m6A 修飾底物的識別 |
| Entacapone | 特異的外周活性的鄰苯二酚-O-甲基轉移酶 (COMT) 抑制劑；競爭性 FTO 抑制劑 |
| Meclofenamic acid | 非甾體類抗炎化合物；FTO 抑制劑 |
縮寫：
MTC: Methyltransferase complexYTHDF: YT521-B homology domain-containing family/YTH domain family
原文閱讀：Sara Zaccara, et al. A Unified Model for the Function of YTHDF Proteins in Regulating M 6A-Modified mRNA. Cell. 2020 Jun 25;181(7):1582-1595.e18.
參考文獻
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1. Sara Zaccara, et al. A Unified Model for the Function of YTHDF Proteins in Regulating M 6A-Modified mRNA. Cell. 2020 Jun 25;181(7):1582-1595.e18.2. Liuer He, et al. Functions of N6-methyladenosine and Its Role in Cancer. Mol Cancer. 2019; 18: 176.
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