脂質(zhì)遞送技術(shù)簡介及其在mRNA新冠疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用

2019年，病毒兇猛，短時(shí)間重創(chuàng)全球。病毒COVID-19通過刺突蛋白S蛋白S1亞基的受體結(jié)合位點(diǎn)（RBD）與受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）的結(jié)合介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。針對這些，各國相繼加入疫苗的研制。

2020年，60多個(gè)候選疫苗批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn),其中mRNA核酸疫苗等疫苗獲批緊急使用或附條件上市。與傳統(tǒng)疫苗相比,mRNA疫苗有很多優(yōu)勢,如制備安全、高效及質(zhì)量可靠。脂質(zhì)遞送技術(shù)應(yīng)用于mRNA疫苗，mRNA疫苗只是脂質(zhì)包裹的一段mRNA分子，其中的mRNA分子進(jìn)入人體后只是把攜帶的抗原信息傳遞出去，表達(dá)出抗原棘突蛋白。

 

現(xiàn)在全球已經(jīng)有多家企業(yè)正在進(jìn)行mRNA疫苗的研發(fā)。脂質(zhì)遞送技術(shù)也將獲得更快發(fā)展。下面我們將對mRNA的研制難點(diǎn)，制備工藝及主要輔料等作一個(gè)簡要的介紹。

 

 

mRNA疫苗的研制面臨三個(gè)主要難點(diǎn):

 

1.1.mRNA非常脆弱，特別不穩(wěn)定，非常容易降解。日常環(huán)境和身體中有很多酶能夠迅速將它們降解。mRNA的不穩(wěn)定對于藥物遞送是困難的。

 

1.2.mRNA在體內(nèi)的有效靶向遞送。

 

1.3.mRNA鏈?zhǔn)且粋�(gè)帶有負(fù)電荷的長鏈大分子。在人體的細(xì)胞表面有一層也帶有負(fù)電荷的細(xì)胞膜， mRNA很難穿過細(xì)胞膜達(dá)到細(xì)胞內(nèi)部。

 

上述三個(gè)難點(diǎn)，脂質(zhì)遞送技術(shù)均能有效解決。脂質(zhì)遞送技術(shù)可以保護(hù)mRNA，防止降解，幫助它們進(jìn)入人體細(xì)胞，有效靶向遞送，協(xié)助它們指導(dǎo)細(xì)胞生成病毒蛋白�？梢哉f沒有脂質(zhì)遞送技術(shù)，就沒有mRNA新冠疫苗。

 

 

截至目前，脂質(zhì)載體已成為遞送 mRNA 最為有效的非病毒載體。用于遞送 mRNA 的脂質(zhì)載體主要包括陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物 (lipoplex，LP)、脂質(zhì)體聚合物(lipopolyplex，LPR)、脂質(zhì)體納米粒(lipid nanoparticle，LNP) 、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NLC)等，其中以脂質(zhì)體納米粒LNP應(yīng)用的最為廣泛。對于脂質(zhì)體遞送 mRNA 來說，不同的給藥途徑對誘導(dǎo)蛋白表達(dá)、給藥頻率及副作用強(qiáng)度具有重要影響。如 LNP 遞送可通過改變給藥途徑來改變 mRNA 體內(nèi)表達(dá)量和持續(xù)時(shí)間，其中肌注和皮內(nèi)注射顯示出比靜脈注射更持久的蛋白表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)RNA-LNP 的外殼是單層的，但也有學(xué)者提出mRNA-LNPs 的外殼由一個(gè)或多個(gè)雙層組成，可見目前的技術(shù)評估m(xù)RNA-LNP 殼的性質(zhì)是困難的，可能存在多種類型的mRNA-LNP 結(jié)構(gòu)，這取決于脂質(zhì)的性質(zhì)和mRNA-LNP 的制備方法。脂質(zhì)體納米粒 LNP外殼由不同的脂質(zhì)組成，每種脂質(zhì)都發(fā)揮著不同的功能，LNP表面主要是中性脂質(zhì)和PEG化脂質(zhì)以及部分可電離的陽離子脂質(zhì)和膽固醇。在核心內(nèi)部，存在可電離的陽離子脂質(zhì)、膽固醇（取決于其濃度）、水和 mRNA 的主要部分。

 

 

mRNA 疫苗中，mRNA（信使核糖核酸）被包裹在脂質(zhì)遞送技術(shù)中，其為 mRNA 提供保護(hù)，并將其安全遞送至人體細(xì)胞，使其在細(xì)胞中釋放，使疫苗起效。通過非共價(jià)親和力和細(xì)胞膜結(jié)合和內(nèi)吞被攝取，進(jìn)入細(xì)胞后 mRNA 逃離內(nèi)吞小泡，被釋放到細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)靶蛋白， BioNTech等均采用LNP技術(shù)。脂質(zhì)遞送也叫脂質(zhì)體包埋，相當(dāng)于一個(gè)基因療法的變體，這個(gè)技術(shù)輝瑞疫苗包埋的完整性最高只有75%，必須用超低溫冷藏。

 

LNP技術(shù)平臺的其中一個(gè)關(guān)鍵輔料是可離子化的脂質(zhì)。脂質(zhì)傳遞系統(tǒng)的可離子化脂質(zhì)的極性隨著pH值的變化會改變，在低pH值的環(huán)境中，它攜帶正電荷，這讓它們可以與mRNA形成復(fù)合體，起到穩(wěn)定mRNA的作用。在生理pH值時(shí)，是中性，減少了它的毒副作用。在脂質(zhì)傳遞系統(tǒng)的外圍，還包裹著聚乙二醇修飾的脂質(zhì)分子（PEGylated lipid），聚乙二醇（PEG）的修飾，它防止脂質(zhì)體聚集在一起，控制脂質(zhì)體顆粒的大小，可起到防止脂質(zhì)體被人體的免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的作用。脂質(zhì)傳遞系統(tǒng)中還包含膽固醇和其它輔助脂質(zhì)分子，協(xié)助構(gòu)成脂質(zhì)傳遞的完整結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)傳遞系統(tǒng)在碰到細(xì)胞膜時(shí)會被細(xì)胞吞入到細(xì)胞內(nèi)形成稱為內(nèi)體（endosome）的囊泡。在細(xì)胞內(nèi)部，內(nèi)體的pH值會降低，導(dǎo)致可離子化的脂質(zhì)分子攜帶正電荷，改變脂質(zhì)傳遞系統(tǒng)的構(gòu)象，促使mRNA從內(nèi)體中解脫出來，與負(fù)責(zé)生產(chǎn)蛋白的核糖體結(jié)合，指導(dǎo)病毒蛋白的合成了。

 

 

基于 mRNA 新冠病毒疫苗的研發(fā)，脂質(zhì)遞送技術(shù)已經(jīng)被證實(shí)是用來遞送 RNA 藥物、疫苗的有效載藥方式。LNP含有多種成分，如何精確控制其組分、粒度、流量、形態(tài)等參數(shù)，同時(shí)還能確保質(zhì)量，加快生產(chǎn)，這可能是 mRNA 疫苗生產(chǎn)最大的難點(diǎn)。傳統(tǒng)的脂質(zhì)體生產(chǎn)方法，比如乙醇注入法、T型混合法、薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、化學(xué)梯度法、pH梯度法、硫酸銨梯度法、醋酸鈣梯度法等，但是這些方法收率低，包封率低，難以用于大批量生產(chǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道采用沖擊式射流混合法可以實(shí)現(xiàn)大生產(chǎn)，利用 BlueShadow 80P 高壓泵，讓疫苗和脂質(zhì)溶液形成兩股射流，在腔體中進(jìn)行對沖，利用流體動力學(xué)讓脂質(zhì)各個(gè)組分充分地混合，形成包裹mRNA的納米脂質(zhì)體顆粒。生產(chǎn)設(shè)備碰撞噴射混合器安裝在潔凈間（C級）內(nèi)。通過中控平臺控制工藝步驟中所有單元的流量。所有單元安裝在不銹鋼框架內(nèi)，以適應(yīng)藥品生產(chǎn)中的 CIP清潔程序。該系統(tǒng)包括：KNAUER 碰撞噴射混合器（IJM)， 脂質(zhì)/乙醇混合物和 mRNA/緩沖液混合物的入口管路，脂質(zhì)體出口管路，CIP在線清潔系統(tǒng)和不銹鋼框架。

 

 

mRNA疫苗其輔料中的關(guān)鍵成分為構(gòu)成LNP的脂質(zhì)材料，其中包括陽離子脂質(zhì)體，PEG化脂質(zhì)體等，解決了mRNA大分子、不穩(wěn)定、易降解的困難，并實(shí)現(xiàn)了mRNA有效地胞內(nèi)遞送。大部分脂質(zhì)材料以進(jìn)口為主，國內(nèi)只有少量品種生產(chǎn)， 其中AVT 公司為國內(nèi)主流脂質(zhì)代理商。AVT 累計(jì)已經(jīng)有多個(gè)在脂質(zhì)體制劑中有所應(yīng)用的磷脂類輔料在CDE獲得了公示，DMG-PEG2000，膽固醇（供注射用），DLin-MC3-DMA，蔗糖（供注射用），海藻糖Hipo-S （供注射用），DSPE-MPEG2000（藥用注射級）等脂質(zhì)體遞送關(guān)鍵輔料都有供應(yīng)。目前 mRNA 新冠病毒疫苗的結(jié)構(gòu)具有有不同的分子和配比結(jié)構(gòu)，但輔料基本相同，主要包括以下幾種：

 

5.1.陽離子脂質(zhì)：與帶負(fù)電的 mRNA 結(jié)合，可高效包載核酸藥物，同時(shí)提供正電荷，與帶負(fù)電荷的mRNA復(fù)合，有助于內(nèi)涵體逃逸，mRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染，可離子化脂質(zhì)具有pH敏感性。

 

5.2.膽固醇：穩(wěn)定LNP結(jié)構(gòu)；調(diào)節(jié)膜流動性，提高粒子穩(wěn)定性。

 

5.3.輔助型脂質(zhì)：常用DOPE，穩(wěn)定粒子，破壞內(nèi)涵體體穩(wěn)定性，提高核酸遞送效率

 

5.4.聚乙二醇化磷脂，延長代謝時(shí)間，提高粒子穩(wěn)定性。減少粒子在體內(nèi)與血漿蛋白的結(jié)合，延長體循環(huán)時(shí)間。

 

5.5.蔗糖，供注射用，提高LNP穩(wěn)定性和mRNA疫苗的穩(wěn)定性，防止脂質(zhì)黏性過大。

 

 

mRNA新冠疫苗非活性成分：

 

處方一：LNP技術(shù)，膜骨架DSPC,陽離子脂質(zhì)ALC-0315,PEG化脂質(zhì)ALC-0159,膽固醇；蔗糖；鹽類，氯化鉀，氯化鈉，磷酸二氫鉀，二水合磷酸氫二鈉。

 

處方二：LNP技術(shù)，膜骨架DSPC,陽離子脂質(zhì)SM-102,PEG化脂質(zhì)PEG2000-DMG,膽固醇；蔗糖；緩沖鹽類，氨丁三醇，氨丁三醇鹽酸鹽，醋酸，醋酸鈉。

 

輝瑞-BioNTech疫苗工藝過程：

 

原液制備：疫苗復(fù)雜生產(chǎn)一般從開始到結(jié)束為60天，其中30天用于測試。每月生產(chǎn)2-3億支。細(xì)菌培養(yǎng)產(chǎn)生稱為質(zhì)粒的DNA環(huán)，其中包含冠狀病毒基因。從主細(xì)胞庫中提取質(zhì)粒瓶，融化。經(jīng)改造的大腸桿菌，將質(zhì)粒帶入細(xì)胞內(nèi)。改造過的細(xì)菌被移至生長培養(yǎng)基中，然后在營養(yǎng)肉湯中發(fā)酵，每20分鐘繁殖一次，并復(fù)制出需要的DNA質(zhì)粒�；瘜W(xué)法分解細(xì)菌，并從其封閉的細(xì)胞中釋放出質(zhì)粒。將質(zhì)粒與先前的樣品進(jìn)行比較，確認(rèn)冠狀病毒基因序列沒有改變，用酶切割并過濾，僅將純化的DNA留在一升的瓶子中。每瓶將產(chǎn)生約150萬劑。每個(gè)DNA瓶都被冷凍，使用酶將DNA轉(zhuǎn)錄成信使RNA或mRNA。測試所得的16升袋裝的mRNA，將其冷凍。

 

脂質(zhì)遞送技術(shù)包裹：油性脂質(zhì)體來保護(hù)mRNA并幫助其進(jìn)入人體細(xì)胞。脂質(zhì)體和mRNA的裸鏈通過碰撞噴射混合在一起，電荷將它們急速混合在一起，形成脂質(zhì)體疫苗顆粒。

 

分裝冷凍：每分鐘575個(gè)小瓶的速度分裝。疫苗冷藏為低溫，但在裝瓶過程中會快速升溫，如果不在冷凍中的時(shí)間過長，mRNA將會變質(zhì)。必須在短于46小時(shí)的時(shí)間將液態(tài)疫苗分裝到小瓶中，馬上進(jìn)行深度冷凍。每195個(gè)裝滿的小瓶放置到一個(gè)小塑料托盤中，然后冷凍。

 

 

目前，新冠疫情依然蔓延，mRNA新冠疫苗也將發(fā)揮更大的作用。作為最重要的載體脂質(zhì)遞送技術(shù)也將獲得更多關(guān)注，其制備工藝、制備材料及表面修飾等方面也會取得了較大的進(jìn)展。據(jù)報(bào)導(dǎo)歐洲有工廠已投巨資進(jìn)行擴(kuò)產(chǎn)新冠疫苗用特殊脂質(zhì)。國內(nèi)目前全球共有 15款mRNA 疫苗在研，其中CuerVac、Moderna、BioNTech被稱為“mRNA國際三巨頭”。 在國內(nèi)，多家本土公司也在開發(fā)新冠mRNA疫苗中，據(jù)了解，國內(nèi)已有 8 家研發(fā)型 mRNA 疫苗企業(yè)，有3家已經(jīng)處于臨床階段了。國內(nèi)脂質(zhì)類輔料需求量將暴增，能促進(jìn)脂質(zhì)遞送技術(shù)的發(fā)展，加快相關(guān)大生產(chǎn)工藝設(shè)備的研制，促進(jìn)脂質(zhì)遞送關(guān)鍵輔料的國產(chǎn)化。

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參考資料：

1.Without these lipid shells, there would be no mRNA vaccines for COVID-19. Retrieved April 27, 2021, from https://cen.acs.org/pharmaceuticals/drug-delivery/Without-lipid-shells-mRNA-vaccines/99/i8

2. Let’s talk about lipid nanoparticles. Retrieved April 27, 2021, from https://www.nature.com/articles/s41578-021-00281-4

3.Aldosari et al., (2021). Lipid Nanoparticles as Delivery Systems for RNA-Based Vaccines. Pharmaceutics, https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13020206.