鐵離子調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡的應(yīng)用

“鐵死亡”這一概念最早在 2012 年由 Dr. Brent R Stockwell 提出，它是一種鐵離子依賴(lài)的新型細(xì)胞調(diào)節(jié)性死亡，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上，生化特征區(qū)別于細(xì)胞凋亡、壞死、自噬。從機(jī)制上簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，鐵死亡是細(xì)胞膜上鐵依賴(lài)性的高表達(dá)的不飽和脂肪酸，發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

 

 

近年來(lái)，鐵死亡相關(guān)研究是如火如荼，前途一片光明。今年 1 月，廣州醫(yī)科大學(xué)唐道林教授團(tuán)隊(duì)在 Nat Rev Clin Oncol 上發(fā)表題為 Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer 的綜述。

 

圖 1. 鐵死亡在癌癥中的作用^[1]

 

在這篇高分綜述中，關(guān)于鐵死亡，作者提出了幾個(gè)觀點(diǎn)：

 

1、鐵死亡 (Ferroptosis) 是一種調(diào)節(jié)性的細(xì)胞死亡，依賴(lài)于鐵介導(dǎo)的氧化損傷。
2、鐵死亡可以通過(guò)兩條主要途徑：外源性 (轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白依賴(lài)) 途徑，內(nèi)源性 (酶調(diào)控) 途徑。
3、鐵積累的增加，自由基的產(chǎn)生，脂肪酸供應(yīng)與脂質(zhì)過(guò)氧化物增加是誘導(dǎo)鐵死亡的關(guān)鍵。

 

 
 
 
鐵死亡的主要途徑
 

■ 外源性 (轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白依賴(lài)) 途徑

 

外源性途徑是通過(guò)抑制細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (System xc^-)，或激活鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白血清轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)的。

 

1、抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)促進(jìn)鐵死亡

System xc^- 是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化體系，該系統(tǒng)由 2 個(gè)亞基組成，SLC7A11 和 SLC3A2。SLC7A11 負(fù)責(zé)主要的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，對(duì)胱氨酸和谷氨酸有高度特異性，而  SLC3A2 則作為伴侶蛋白。System xc^- 以 1:1 的比例用胞內(nèi)谷氨酸來(lái)?yè)Q取胞外的胱氨酸 (Cys₂)，胱氨酸在谷氨酸半胱氨酸連接酶 (GCL) 和谷胱甘肽合成酶 (GSS) 的催化作用下合成谷胱甘肽 (GSH)。

 

GSH 是膜脂修復(fù)酶——谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GPX4) 的還原性輔因子。抑制 System xc^- 的活性會(huì)抑制胱氨酸的吸收，影響 GSH 的合成，繼而導(dǎo)致膜脂修復(fù)酶 GPX4 活性降低，細(xì)胞抗氧化能力降低，從而促進(jìn)鐵死亡。

 

2、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與鐵 “超載”

增加鐵的吸收，減少鐵的儲(chǔ)存和限制鐵的外流都會(huì)導(dǎo)致鐵積累增加，然后通過(guò)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)促進(jìn)鐵死亡。

 

轉(zhuǎn)鐵蛋白 (血清轉(zhuǎn)鐵蛋白或乳鐵蛋白) 通過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 (TFRC) 介導(dǎo)鐵攝取，F(xiàn)TH1/FTL (鐵蛋白組件) 通過(guò)自噬降解可以增加鐵的水平，這些都可以促進(jìn)鐵死亡。而 SLC40A1 介導(dǎo)的鐵外流和外泌體介導(dǎo)的鐵蛋白輸出會(huì)抑制鐵死亡。

 

 

■ 內(nèi)源性 (酶調(diào)控) 途徑

 

內(nèi)源性途徑是通過(guò)阻斷細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶 (如 GPX4) 激活的。

 

1、抑制 GPX4 誘導(dǎo)鐵死亡

脂質(zhì)過(guò)氧化物積累是鐵死亡的標(biāo)志。GPX4 可將細(xì)胞毒性脂質(zhì)過(guò)氧化物 (L-OOH) 還原為相應(yīng)的醇 (L-OH)，抑制 GPX4 活性會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累。 

 

直接抑制：如 RSL3 作為鐵死亡誘導(dǎo)劑，可直接作用于 GPX4 并抑制其活性，因此降低了細(xì)胞的抗氧化能力并積累了 ROS，從而導(dǎo)致鐵死亡。

 

間接抑制：前面提到的抑制 GSH 的合成；硒代半胱氨酸是 GPX4 活性基團(tuán)的必需氨基酸之一，抑制甲羥戊酸途徑可下調(diào)硒代半胱氨酸 tRNA 的成熟來(lái)影響  GPX4 的合成，從而影響 GPX4 的活性并誘導(dǎo)鐵死亡。
 

2、其他酶的調(diào)節(jié)途徑與脂肪酸積累

乙酰輔酶 A 羧化酶 (ACAC) 介導(dǎo)的脂肪酸合成，脂質(zhì)吞噬 (Lipophagy) 介導(dǎo)的脂肪酸釋放，可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸的積累，促進(jìn)鐵死亡。

 

長(zhǎng)鏈脂肪酸輔酶 A 連接酶 4 (ACSL4) 和溶血磷脂�；�轉(zhuǎn)移酶 3 (LPCAT3) 促進(jìn)多不飽和脂肪酸 (PUFA) 摻入磷脂中形成多不飽和脂肪酸的磷脂 (PUFA-PL)。PUFA-PLs 易受脂氧合酶 (ALOXs) 介導(dǎo)的自由基引發(fā)的氧化作用。這種氧化作用最終會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)雙層的破壞并影響膜功能，從而促進(jìn)鐵死亡。

 
 
 
鐵死亡的研究策略
 

上文介紹了鐵死亡的基本途徑。鐵死亡有哪些研究策略呢？下面以文獻(xiàn) Energy-stress-mediated AMPK activation inhibits ferroptosis 為例。

 

作者團(tuán)隊(duì)建立了特定病理過(guò)程 (鐵死亡) 的細(xì)胞模型，使用多種誘導(dǎo)劑和抑制劑，以及多種檢測(cè)方法證明鐵死亡與 AMPK 的調(diào)控關(guān)系，并建立了 AMPKα1/α2 的基因敲除細(xì)胞系 (AMPK DKO)，驗(yàn)證 AMPK 缺失對(duì)鐵死亡敏感性的作用機(jī)制。

 

■ 確立鐵死亡病理模型

 

1、能量應(yīng)激 (Energy stress) 抑制鐵死亡

首先，研究人員探索了永生化小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 (MEFs) 中，葡萄糖饑餓條件對(duì) Erastin 誘導(dǎo)的鐵死亡的影響。首先，證明 Erastin 誘導(dǎo)鐵死亡：Caspase-3 或 PARP 裂解均未下調(diào) (細(xì)胞凋亡的標(biāo)志)，而且鐵死亡抑制劑 Ferrostatin-1 可以逆轉(zhuǎn) Erastin 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。最初他們預(yù)想，葡萄糖饑餓的條件會(huì)增強(qiáng)  Erastin 誘導(dǎo)的鐵死亡，結(jié)果恰恰相反：葡萄糖饑餓很大程度上逆轉(zhuǎn)了 MEFs 中引起的鐵死亡。

 

 

作者團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步選擇了其他可誘導(dǎo)或模擬能量應(yīng)激的化合物，包括 2-脫氧葡萄糖 (2-DG)、阿卡地新 (AICAR)、A769662。這些化合物也顯著抑制了由 Erastin 處理引起的脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡。綜上所述，能量應(yīng)激抑制了鐵死亡。

 

2、AMPKα1/α2 的基因敲除細(xì)胞系建立

上述模擬或誘導(dǎo)能量應(yīng)激的化合物均會(huì)激活 AMPK，那么 AMPK 是否參與能量應(yīng)激介導(dǎo)的鐵死亡抑制？MEFs 中，如圖 4a-b，AMPK 雙敲除 (DKO) 可以完全逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)能量應(yīng)激的化合物對(duì) Erastin 誘導(dǎo)的鐵死亡的抑制作用。

 

緊接著，如圖 4c，作者又驗(yàn)證了一組細(xì)胞系中的基礎(chǔ) AMPK 激活狀態(tài) (p-AMPK Thr172 為激活標(biāo)志) 與鐵死亡 (SLC7A11 的表達(dá)水平) 相關(guān)性。并且如圖 4c-d 所示，SLC7A11 高表達(dá)細(xì)胞相對(duì)于低表達(dá)細(xì)胞對(duì)鐵死亡的抵抗力更高，值得注意的是，雖然在 SLC7A11 高表達(dá)細(xì)胞中 AMPK 激活狀態(tài)與鐵死亡的敏感性無(wú)關(guān)，但 SLC7A11 低表達(dá)細(xì)胞中 AMPK 的激活與鐵死亡敏感性呈負(fù)相關(guān)。以上數(shù)據(jù)表明能量應(yīng)激部分通過(guò) AMPK 抑制了鐵死亡。
 

 

3、AMPK 失活使癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感

AMPK 在高基礎(chǔ) AMPK 磷酸化水平的癌細(xì)胞系中是否會(huì)促進(jìn)鐵死亡抗性？AMPK 抑制劑 Compound C 可下調(diào) AMPK 的激活，如圖 5a-b，Compound C 處理使 ACHN 細(xì)胞 (高基礎(chǔ) AMPK 磷酸化的抗鐵堿化細(xì)胞系) 對(duì) Erastin 或胱氨酸耗竭變敏感。透射電子顯微鏡 (TEM) 的結(jié)果也顯示，ACHN 細(xì)胞中，Compound C 與 Erastin 或胱氨酸耗竭共同處理導(dǎo)致線(xiàn)粒體收縮，膜密度增加，但細(xì)胞核中沒(méi)有明顯的 DNA 片段化 (鐵死亡的細(xì)胞特征形態(tài)特征)。這表明 AMPK 的抑制使癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感。

 

圖 5. Erastin 或胱氨酸耗竭條件下 ACHN 細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性

(a-b. CCK8 法和脂質(zhì)過(guò)氧化測(cè)定法檢測(cè)，Erastin 或胱氨酸耗竭條件下 ACHN 細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性；c. 透射電子顯微鏡 (TEM) 分析)

 

綜上所述，能量應(yīng)激對(duì)鐵死亡的抑制作用，并且這種抑制作用部分是通過(guò) AMPK 的激活實(shí)現(xiàn)的。
 

總結(jié)：

1、GSH-GPX4 抗氧化系統(tǒng)在鐵死亡途徑中起重要作用。脂質(zhì)過(guò)氧化物增加，轉(zhuǎn)鐵蛋白等介導(dǎo)的鐵的積累，以及細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸的積累都可以誘導(dǎo)鐵死亡。

 

2、Hyemin Lee 等人使用鐵死亡通路相關(guān)的抑制劑/誘導(dǎo)劑，以及建立了 AMPK 敲除細(xì)胞系，證明鐵死亡與 AMPK 之間的調(diào)節(jié)關(guān)系。

 

3、常見(jiàn)的檢測(cè)鐵死亡的實(shí)驗(yàn)方法：鐵死亡相關(guān)細(xì)胞存活分析，如文中的 CCK8 法 (其他細(xì)胞活力檢測(cè)方法還包括 MTT 法，臺(tái)盼藍(lán)染色等)。

 

4、除了細(xì)胞活力測(cè)定，脂質(zhì)氧化水平的測(cè)定 (文中的 C11 BODIPY 581/591 染色)，GSH 測(cè)定，線(xiàn)粒體 ROS 測(cè)定，以及 GPX4 活性測(cè)定，電鏡下線(xiàn)粒體的變化的監(jiān)測(cè)，特異性靶標(biāo)分子的分析 (WB、IHC、IF 等) 也是常用的檢測(cè)手段。

 

相關(guān)產(chǎn)品

Erastin 鐵死亡誘導(dǎo)劑，結(jié)合且抑制電壓依賴(lài)性陰離子通道 (VDAC2/VDAC3)。

RSL3 鐵死亡誘導(dǎo)劑，可直接降低 GPX4 的表達(dá)。

L-Cystine 一種氨基酸，在細(xì)胞調(diào)節(jié)過(guò)程中起著重要作用，胱氨酸耗竭會(huì)誘導(dǎo)鐵死亡。

Ferrostatin-1 選擇性的鐵死亡抑制劑，人工合成的抗氧化劑，通過(guò)還原機(jī)制來(lái)防止膜脂的損傷，從而抑制細(xì)胞死亡。

AICAR 腺苷類(lèi)似物，也是一種 AMPK 激活劑，調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)的代謝。

A-769662 有效的，可逆的 AMPK 激活劑，EC50 值為 0.8 μM。

Compound C dihydrochloride 選擇性 AMPK 抑制劑，可參與細(xì)胞自噬以及鐵死亡。

CCK8 試劑盒  細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性檢測(cè)的快速、高靈敏度試劑盒。

Thiazolyl Blue (‍‍MTT)‍‍ 可用于細(xì)胞增殖，活性毒性的檢測(cè)。

H2DCFDA 可滲透細(xì)胞的，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧 (ROS) 水平的探針。

JC-1 試劑盒 用于測(cè)量線(xiàn)粒體膜電位的熒光探針試劑盒。

TMRM Perchlorate 親脂性紅色熒光染料，可用于線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)。

鐵死亡化合物庫(kù) 收集了 500+ 種文獻(xiàn)報(bào)道的具有誘導(dǎo)或抑制鐵死亡相關(guān)的化合物及與鐵死亡密切相關(guān)的靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的化合物，可以用于鐵死亡機(jī)制及相關(guān)疾病的研究。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)

 
縮寫(xiě)

RCD: Regulated cell death

System xc^-: The cystine/glutamate transporter
ACAC:  Acetyl-CoA carboxylase
ACSL4：Acid-CoA ligase 4
GSH: Glutathione  
GCL: Glutamate-cysteine ligase  
GSS:  Glutathione synthetase  
Cys₂：Cystine
GPX4: Glutathione peroxidase  
TFRC: Iron-loaded serotransferrin-transferrin receptor  
FTH1/FTL: Ferritin component
WB：Western Blot
IHC: Immunohistochemistry
IF: Immunofluorescence
 
參考文獻(xiàn)

1. Daolin Tang, Xin Chen, Rui Kang, Guido Kroemer. Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2021 Jan 29.
2. Hyemin Lee, et al. Energy-stress-mediated AMPK activation inhibits ferroptosis. Nat Cell Biol. 2020 Feb; 22(2): 225-234.

3. Jie Li, Feng Cao , He-Liang Yin, et al. Ferroptosis: past, present and future. Cell Death Dis. 2020 Feb 3;11(2):88.
4. Caicun Zhou, Xuefei Li, et al. Targeting ferroptosis for cancer therapy: exploring novel strategies from its mechanisms and role in cancers. Transl Lung Cancer Res. 2020 Aug;9(4):1569-1584.