細胞微環(huán)境精準控制，AVATAR讓細胞在體外“不忘初心，牢記使命”
高度分化的心肌細胞幾乎沒有增殖能力，從使得在心臟損傷或疾病的治療及研究中常因心肌細胞供應(yīng)不足而受到限制。借助再生醫(yī)學(xué)是近年來生成大量心肌細胞的常用手段。一般是將人多能干細胞（hPSCs）置于標準培養(yǎng)箱的常氧條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)其向心肌細胞方向生長和分化，但結(jié)果并不是特別理想。
那么，如何才能得到大量優(yōu)質(zhì)的心肌細胞呢？
研究人員在心肌細胞增值實驗中，同時使用了標準培養(yǎng)箱和可以控制氧氣濃度和壓力水平的AVATAR系統(tǒng)，得到了意想不到的效果。
研究人員使用標準培養(yǎng)箱和AVATAR系統(tǒng)，將細胞群分為三組：常氧常壓（標準培養(yǎng)箱），5%O2和0 PSI（AVATAR），5%O2和2 PSI（AVATAR），從Figure 1可以觀測到保持氧氣恒定和微調(diào)壓力確實對細胞的生長產(chǎn)生了影響。接著，研究人員進一步評估了心肌細胞生成的效率。
對于晚期心肌細胞成熟，AVATAR系統(tǒng)通過對壓力的精細調(diào)控可以看到在鈣松弛動力學(xué)和收縮參數(shù)方面顯示出明顯的改善，從而提高了晚期細胞的健康和活力。
在過去多年的時間里，有許多研究者在探索哪些重要的微環(huán)境因素，對于維持或改變細胞狀態(tài)有較重要的決定意義。他們研究發(fā)現(xiàn)，微環(huán)境中的氧氣濃度與壓力水平變化，對于細胞的形態(tài)、基因和蛋白表達水平，甚至表型功能都起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。因此，如能借由控制氧氣濃度與壓力水平創(chuàng)造適宜的細胞微環(huán)境，將能精準控制細胞狀態(tài)與功能表達，這種技術(shù)也將提供給研究者非常重要的價值。
Figure 4：the human microenvironment is hypoxic and pressurized
在人體微環(huán)境中，氧氣和壓力具有明顯的生理效應(yīng)，并且都發(fā)揮著重要且獨立的作用。人體中的組織長期處于缺氧和加壓狀態(tài)。與典型CO2培養(yǎng)箱中的環(huán)境相比，人體中的組織的氧氣水平低得多，并且不同的組織和器官類型所受的間質(zhì)流體壓力也不同。在缺氧和加壓培養(yǎng)條件下，細胞形態(tài)、基因和蛋白質(zhì)表達發(fā)生變化。在細胞培養(yǎng)過程中，大氣壓力的調(diào)控時刻影響著細胞功能的生物學(xué)特征，并對細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和代謝產(chǎn)生深遠影響。
Figure 5:Modulation of pressure & oxygen has profound effects on cell homeostasis
現(xiàn)有細胞培養(yǎng)箱的條件都是20%氧氣、5%二氧化碳、幾乎沒有額外的壓力，但是動物和人體內(nèi)細胞往往處于低氧高壓環(huán)境。錯誤的培養(yǎng)環(huán)境，往往會產(chǎn)生有偏差、甚至錯誤的結(jié)果。
Figure 6：AVATAR System
AVATAR個體化細胞控制系統(tǒng)可以自由控制氧氣含量和壓力強度，結(jié)合Xcell Biosciences公司開發(fā)的方法，可以針對不同的細胞，模擬出它們在體內(nèi)不同部位所處的微環(huán)境，接近真實的環(huán)境可幫助您獲得科學(xué)的結(jié)果、開發(fā)出有效的藥物，并大幅減少優(yōu)化時間與成本花費。
Figure 7：AVATAR System
1.創(chuàng)造低氧高壓條件，模擬體內(nèi)微環(huán)境
自由控制氧氣含量和壓力強度，為所研究的細胞創(chuàng)造符合其在體內(nèi)的微環(huán)境。
2.縮小體外與體內(nèi)細胞實驗結(jié)果間的差異
模擬細胞在體內(nèi)的微環(huán)境，因此細胞的狀態(tài)也就更加真實，實驗結(jié)果和體內(nèi)實驗相當。
3.有效精準控制細胞狀態(tài)
除了可模擬體內(nèi)微環(huán)境外，更可借由參數(shù)的調(diào)整與優(yōu)化，控制細胞的狀態(tài)與命運（如維持干細胞干性表征、定向誘導(dǎo)干細胞分化、提高基因編輯與轉(zhuǎn)染的效率等），相較傳統(tǒng)方式能更有效的提高反應(yīng)效果，不僅可縮短時效，更可減低實驗過程中所需成本花費。
4.多通道且獨立的設(shè)計和便捷的可升級性
研究者可根據(jù)需求選擇多臺獨立腔體疊加放置，同時設(shè)置不同的環(huán)境條件。研究者可以橫跨不同的生理理狀態(tài)去評估細胞的基因與功能，或根據(jù)需求，采取多參數(shù)設(shè)置模式快速獲得更佳的生長條件，大幅減少優(yōu)化時間與成本花費。
5.空間占用小
可靈活地放置于任何常規(guī)環(huán)境，也可放置于特定空間，如超凈工作臺等，適合特殊應(yīng)用需求，如病毒或病原相關(guān)研究。
6. 顯著降低運行成本
設(shè)備配置精密感應(yīng)器與氣體控制部件，因此可較傳統(tǒng)培養(yǎng)裝置降低≥90%的⽓體消耗。
01 為研究者提供高質(zhì)量的患者反應(yīng)數(shù)據(jù)
Figure 8：Live-cell imaging of CAR-T killing assay with primary tumor cells under time-lapse
Left:30 min time-lapse movie; standard CO2 incubator
Right:8 hour time-lapse movie; tumor microenvironment
AVATAR不僅可有效擴增免疫細胞，更可借由條件的設(shè)置達到免疫細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)的目的，因此可以獲得與體內(nèi)實驗吻合的科學(xué)數(shù)據(jù)。CAR-T 免疫殺傷腫瘤細胞實驗，左圖在為在常規(guī)標準CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，結(jié)果顯示某CAR-T產(chǎn)品對腫瘤細胞的殺傷效果很好，30分鐘內(nèi)即可見顯著效果；但是后期的動物實驗表明，該CAR-T產(chǎn)品在動物體內(nèi)沒有療效，這導(dǎo)致該CAR-T開發(fā)陷入歧途。而將細胞置于AVATAR模擬的體內(nèi)低氧高壓的微環(huán)境中培養(yǎng)得到的結(jié)果顯示，該CAR-T沒有作用，即使8小時也未見殺傷效果，這個結(jié)果與體內(nèi)實驗結(jié)果吻合。
02 高質(zhì)量擴增免疫T細胞
Figure 9：T-cell Expansion in AVATA Without the Need for Bead Activation
利用AVATAR快速擴增未分化的免疫細胞。在常規(guī)環(huán)境下，T細胞體外增殖需要CD3/CD28的刺激（灰色曲線），但這會導(dǎo)致T細胞分化，多能性降低。而將細胞置于AVATAR模擬的低氧高壓的微環(huán)境中培養(yǎng)，T細胞不需要刺激即可在體外增殖，而且速度更快（紅色曲線），且保留T細胞的多能性。
03 促進多能干細胞重編程
Figure 10：Tune AVATAR culture settings to promote ‘stemness’ by inducing expression of Nanog, Oct4, Sox2
利用AVATAR保留細胞干性。干細胞研究中，利用傳統(tǒng)方法維持細胞的干性相當困難，AVATAR系統(tǒng)解決了這一難題。絕大多數(shù)基因的表達受到氧氣與壓力的調(diào)控，如Figure10顯示，維持細胞干性相關(guān)的三個基因Nanog，Oct4，和Sox2在AVATAR低氧高壓的環(huán)境下，相比常規(guī)環(huán)境表達量更高，從而可以很好地維持細胞的干性，確保其不分化。
04 類器官培養(yǎng)
類器官的研究對于發(fā)育生物學(xué)、疾病病理學(xué)、免疫腫瘤學(xué)、精準治療等研究領(lǐng)域相當重要。細胞研究過程中最常面臨幾個問題，包括干細胞的重編程效率、培養(yǎng)過程中干性的維持與定向誘導(dǎo)分化的控制與效率。通過常規(guī)的方法，很難在體外培養(yǎng)出所需合適的類器官。
Figure 11：Prostate tumor organoids after 2 weeks in culture using the AVATAR System
已有許多文獻與數(shù)據(jù)支持借由低氧、高壓等條件的設(shè)置，能大大提升培養(yǎng)合適類器官的效率，同時較一般培養(yǎng)方式展現(xiàn)出更強大的干細胞特性，甚至通過對不同參數(shù)的優(yōu)化，能夠促進定向分化并獲得更多且具功能性的細胞球或類器官，極大地縮短了構(gòu)建PDX模型的時間。因此，能夠自由控制氧氣含量和壓力強度的AVATAR系統(tǒng)，是您培養(yǎng)2D或3D的懸浮類器官或貼壁類器官的理想選擇。
AVATAR可以應(yīng)用于原代細胞培養(yǎng)、藥物篩選、免疫細胞體外增殖、PDX模型和類器官形成、循環(huán)腫瘤細胞的捕獲和增殖、提高基因編輯的效率、胚胎干細胞和誘導(dǎo)多能干細胞的干性維持和定向誘導(dǎo)分化。
目前AVATAR已在多個國際知名研究機構(gòu)與醫(yī)藥企業(yè)投入使用，包括倫敦癌癥研究所、英國劍橋癌癥研究所、拜耳醫(yī)藥、京都大學(xué)iPS細胞研究所、加州大學(xué)舊金山分校(UCSF)Helen Diller Family癌癥綜合中心等。
那么，如何才能得到大量優(yōu)質(zhì)的心肌細胞呢？
研究人員在心肌細胞增值實驗中，同時使用了標準培養(yǎng)箱和可以控制氧氣濃度和壓力水平的AVATAR系統(tǒng)，得到了意想不到的效果。
研究人員使用標準培養(yǎng)箱和AVATAR系統(tǒng)，將細胞群分為三組：常氧常壓（標準培養(yǎng)箱），5%O2和0 PSI（AVATAR），5%O2和2 PSI（AVATAR），從Figure 1可以觀測到保持氧氣恒定和微調(diào)壓力確實對細胞的生長產(chǎn)生了影響。接著，研究人員進一步評估了心肌細胞生成的效率。
結(jié)果展示
對于晚期心肌細胞成熟，AVATAR系統(tǒng)通過對壓力的精細調(diào)控可以看到在鈣松弛動力學(xué)和收縮參數(shù)方面顯示出明顯的改善，從而提高了晚期細胞的健康和活力。
每種細胞都有屬于自己的微環(huán)境
在過去多年的時間里，有許多研究者在探索哪些重要的微環(huán)境因素，對于維持或改變細胞狀態(tài)有較重要的決定意義。他們研究發(fā)現(xiàn)，微環(huán)境中的氧氣濃度與壓力水平變化，對于細胞的形態(tài)、基因和蛋白表達水平，甚至表型功能都起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。因此，如能借由控制氧氣濃度與壓力水平創(chuàng)造適宜的細胞微環(huán)境，將能精準控制細胞狀態(tài)與功能表達，這種技術(shù)也將提供給研究者非常重要的價值。
Figure 4：the human microenvironment is hypoxic and pressurized
在人體微環(huán)境中，氧氣和壓力具有明顯的生理效應(yīng)，并且都發(fā)揮著重要且獨立的作用。人體中的組織長期處于缺氧和加壓狀態(tài)。與典型CO2培養(yǎng)箱中的環(huán)境相比，人體中的組織的氧氣水平低得多，并且不同的組織和器官類型所受的間質(zhì)流體壓力也不同。在缺氧和加壓培養(yǎng)條件下，細胞形態(tài)、基因和蛋白質(zhì)表達發(fā)生變化。在細胞培養(yǎng)過程中，大氣壓力的調(diào)控時刻影響著細胞功能的生物學(xué)特征，并對細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和代謝產(chǎn)生深遠影響。
Figure 5:Modulation of pressure & oxygen has profound effects on cell homeostasis
現(xiàn)有細胞培養(yǎng)箱的條件都是20%氧氣、5%二氧化碳、幾乎沒有額外的壓力，但是動物和人體內(nèi)細胞往往處于低氧高壓環(huán)境。錯誤的培養(yǎng)環(huán)境，往往會產(chǎn)生有偏差、甚至錯誤的結(jié)果。
Figure 6：AVATAR System
AVATAR個體化細胞控制系統(tǒng)可以自由控制氧氣含量和壓力強度，結(jié)合Xcell Biosciences公司開發(fā)的方法，可以針對不同的細胞，模擬出它們在體內(nèi)不同部位所處的微環(huán)境，接近真實的環(huán)境可幫助您獲得科學(xué)的結(jié)果、開發(fā)出有效的藥物，并大幅減少優(yōu)化時間與成本花費。
AVATAR 技術(shù)優(yōu)勢
Figure 7：AVATAR System
1.創(chuàng)造低氧高壓條件，模擬體內(nèi)微環(huán)境
自由控制氧氣含量和壓力強度，為所研究的細胞創(chuàng)造符合其在體內(nèi)的微環(huán)境。
2.縮小體外與體內(nèi)細胞實驗結(jié)果間的差異
模擬細胞在體內(nèi)的微環(huán)境，因此細胞的狀態(tài)也就更加真實，實驗結(jié)果和體內(nèi)實驗相當。
3.有效精準控制細胞狀態(tài)
除了可模擬體內(nèi)微環(huán)境外，更可借由參數(shù)的調(diào)整與優(yōu)化，控制細胞的狀態(tài)與命運（如維持干細胞干性表征、定向誘導(dǎo)干細胞分化、提高基因編輯與轉(zhuǎn)染的效率等），相較傳統(tǒng)方式能更有效的提高反應(yīng)效果，不僅可縮短時效，更可減低實驗過程中所需成本花費。
4.多通道且獨立的設(shè)計和便捷的可升級性
研究者可根據(jù)需求選擇多臺獨立腔體疊加放置，同時設(shè)置不同的環(huán)境條件。研究者可以橫跨不同的生理理狀態(tài)去評估細胞的基因與功能，或根據(jù)需求，采取多參數(shù)設(shè)置模式快速獲得更佳的生長條件，大幅減少優(yōu)化時間與成本花費。
5.空間占用小
可靈活地放置于任何常規(guī)環(huán)境，也可放置于特定空間，如超凈工作臺等，適合特殊應(yīng)用需求，如病毒或病原相關(guān)研究。
6. 顯著降低運行成本
設(shè)備配置精密感應(yīng)器與氣體控制部件，因此可較傳統(tǒng)培養(yǎng)裝置降低≥90%的⽓體消耗。
AVATAR 客戶案例
01 為研究者提供高質(zhì)量的患者反應(yīng)數(shù)據(jù)
Figure 8：Live-cell imaging of CAR-T killing assay with primary tumor cells under time-lapse
Left:30 min time-lapse movie; standard CO2 incubator
Right:8 hour time-lapse movie; tumor microenvironment
AVATAR不僅可有效擴增免疫細胞，更可借由條件的設(shè)置達到免疫細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)的目的，因此可以獲得與體內(nèi)實驗吻合的科學(xué)數(shù)據(jù)。CAR-T 免疫殺傷腫瘤細胞實驗，左圖在為在常規(guī)標準CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，結(jié)果顯示某CAR-T產(chǎn)品對腫瘤細胞的殺傷效果很好，30分鐘內(nèi)即可見顯著效果；但是后期的動物實驗表明，該CAR-T產(chǎn)品在動物體內(nèi)沒有療效，這導(dǎo)致該CAR-T開發(fā)陷入歧途。而將細胞置于AVATAR模擬的體內(nèi)低氧高壓的微環(huán)境中培養(yǎng)得到的結(jié)果顯示，該CAR-T沒有作用，即使8小時也未見殺傷效果，這個結(jié)果與體內(nèi)實驗結(jié)果吻合。
02 高質(zhì)量擴增免疫T細胞
Figure 9：T-cell Expansion in AVATA Without the Need for Bead Activation
利用AVATAR快速擴增未分化的免疫細胞。在常規(guī)環(huán)境下，T細胞體外增殖需要CD3/CD28的刺激（灰色曲線），但這會導(dǎo)致T細胞分化，多能性降低。而將細胞置于AVATAR模擬的低氧高壓的微環(huán)境中培養(yǎng)，T細胞不需要刺激即可在體外增殖，而且速度更快（紅色曲線），且保留T細胞的多能性。
03 促進多能干細胞重編程
Figure 10：Tune AVATAR culture settings to promote ‘stemness’ by inducing expression of Nanog, Oct4, Sox2
利用AVATAR保留細胞干性。干細胞研究中，利用傳統(tǒng)方法維持細胞的干性相當困難，AVATAR系統(tǒng)解決了這一難題。絕大多數(shù)基因的表達受到氧氣與壓力的調(diào)控，如Figure10顯示，維持細胞干性相關(guān)的三個基因Nanog，Oct4，和Sox2在AVATAR低氧高壓的環(huán)境下，相比常規(guī)環(huán)境表達量更高，從而可以很好地維持細胞的干性，確保其不分化。
04 類器官培養(yǎng)
類器官的研究對于發(fā)育生物學(xué)、疾病病理學(xué)、免疫腫瘤學(xué)、精準治療等研究領(lǐng)域相當重要。細胞研究過程中最常面臨幾個問題，包括干細胞的重編程效率、培養(yǎng)過程中干性的維持與定向誘導(dǎo)分化的控制與效率。通過常規(guī)的方法，很難在體外培養(yǎng)出所需合適的類器官。
Figure 11：Prostate tumor organoids after 2 weeks in culture using the AVATAR System
已有許多文獻與數(shù)據(jù)支持借由低氧、高壓等條件的設(shè)置，能大大提升培養(yǎng)合適類器官的效率，同時較一般培養(yǎng)方式展現(xiàn)出更強大的干細胞特性，甚至通過對不同參數(shù)的優(yōu)化，能夠促進定向分化并獲得更多且具功能性的細胞球或類器官，極大地縮短了構(gòu)建PDX模型的時間。因此，能夠自由控制氧氣含量和壓力強度的AVATAR系統(tǒng)，是您培養(yǎng)2D或3D的懸浮類器官或貼壁類器官的理想選擇。
AVATAR 應(yīng)用方向
AVATAR可以應(yīng)用于原代細胞培養(yǎng)、藥物篩選、免疫細胞體外增殖、PDX模型和類器官形成、循環(huán)腫瘤細胞的捕獲和增殖、提高基因編輯的效率、胚胎干細胞和誘導(dǎo)多能干細胞的干性維持和定向誘導(dǎo)分化。
目前AVATAR已在多個國際知名研究機構(gòu)與醫(yī)藥企業(yè)投入使用，包括倫敦癌癥研究所、英國劍橋癌癥研究所、拜耳醫(yī)藥、京都大學(xué)iPS細胞研究所、加州大學(xué)舊金山分校(UCSF)Helen Diller Family癌癥綜合中心等。
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