基質(zhì)硬度通過 p-PXN-Rac1-YAP 信號(hào)軸調(diào)節(jié)細(xì)胞形成

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【研究背景】

血管生成是指從現(xiàn)有血管中內(nèi)皮細(xì)胞生長而生成新的血管，一旦血管開始生成，被稱為細(xì)胞的特殊內(nèi)皮細(xì)胞就會(huì)開始發(fā)芽過程。由此，血管芽內(nèi)皮細(xì)胞的長出標(biāo)志著血管生成的開始，這一過程在生理學(xué)和病理生理學(xué)過程中至關(guān)重要。然而，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的機(jī)械特性如何調(diào)節(jié)細(xì)胞的形成在一定程度上被忽視了。細(xì)胞的特性是血管生成和組織工程的關(guān)鍵，它可以定向遷移到無血管區(qū)域，對(duì)最終形成的血管形態(tài)起決定作用。迄今為止，各種生化信號(hào)分子因素如 MST1-FOXO1等多見報(bào)道，然而功能血管的建立需要生化和生物力學(xué)信號(hào)線索的結(jié)合，后者取決于組織工程和再生醫(yī)學(xué)中使用的生物材料的特性。
 

近期，北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院的郭亞茹博士以作者在Bioactive Materials發(fā)表了題為：Matrix stiffness modulates tip cell formation through the p-PXN-Rac1-YAP signaling axis的研究文章。文章報(bào)道了基質(zhì)硬度通過p-PXN-Rac1-YAP信號(hào)軸調(diào)節(jié)細(xì)胞形成，這項(xiàng)工作不僅有助于在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中尋找最佳材料，也為腫瘤治療和病理性血管再生提供了新的治療策略。在生物材料設(shè)計(jì)和治療一些病理情況方面具有特殊意義。鄧旭亮教授為本文通訊作者。

【研究概述】

在這項(xiàng)研究中，作者研究了基質(zhì)硬度對(duì)細(xì)胞形成的影響，并探索了基礎(chǔ)機(jī)制。在肝癌細(xì)胞的外層發(fā)現(xiàn)CD31表達(dá)更高，組織硬度也更高�；�質(zhì)的硬度增加可以顯著增加血管的生成和細(xì)胞富集基因的表達(dá)。硬度較大的基質(zhì)增加了FAK和p-PXN的局灶黏附，提高了活性Rac1的水平，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞剛度增加。隨后，YAP作為下游的力效應(yīng)因子被激活并易位入核，上調(diào)靶基因的表達(dá)，最終促進(jìn)細(xì)胞的形成。p-PXN還可以減少細(xì)胞間的連接，從而促進(jìn)細(xì)胞的形成。由此表明：基質(zhì)硬度可通過p-PXN-Rac1-YAP信號(hào)軸調(diào)節(jié)細(xì)胞的形成。

【研究結(jié)果】

硬度的增加還可以促進(jìn)血管的生成（圖1D），從三維（3D）EC球體（圖1E）的芽入侵距離增加可證明這一點(diǎn)。與GM60和GM30凝膠（圖1F）相比，硬凝膠（GM90）中球體的芽數(shù)量增加了2倍。qPCR分析表明，細(xì)胞富集基因，包括CD34、VEGFR2、DLL4、CXCR4、EFNB2和IGF2，在GM90基質(zhì)（圖1G）中顯著上升。同時(shí)，更硬的凝膠中芽的寬度更厚，矩陣中含有更多和長的纖維狀體（圖1H和I）。由此數(shù)據(jù)表明，基質(zhì)硬度增加可以促進(jìn)血管生成和細(xì)胞的形成。
 

圖1. 基質(zhì)硬度增強(qiáng)血管生成和細(xì)胞在體外和體內(nèi)的形成。

在EC球形發(fā)芽模型中，從球體中產(chǎn)生的最外層細(xì)胞和以下細(xì)胞分別被定義為細(xì)胞和莖細(xì)胞。未爬出球體的細(xì)胞被定義為密集細(xì)胞（圖2A）。通過原子力顯微鏡（AFM），我們檢測(cè)到每個(gè)細(xì)胞的16個(gè)位置，并制作了典型的力學(xué)熱圖（圖2B）。細(xì)胞的剛度在數(shù)量上是莖細(xì)胞的兩倍，是咽細(xì)胞的四倍（圖2C）。此外，免疫熒光染色表明，細(xì)胞顯示長應(yīng)力纖維的增強(qiáng)組裝，而在莖和密集細(xì)胞作用捆綁是相對(duì)較短的，并限制在細(xì)胞外圍（圖2D）。研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的YAT顯示出明顯的核定位，而YAT在咽細(xì)胞（圖2D和E）中成為細(xì)胞質(zhì)。通過免疫熒光、多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM技術(shù)和原子力顯微鏡AFM，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞擴(kuò)散區(qū)域增加（圖3A），粘附力（圖3B和C）和細(xì)胞硬度（圖3D），這表明 EC-ECM 連接增加，并通過 ECM 硬化提升細(xì)胞機(jī)械特性。另外，VP（YEP抑制劑）治療顯著降低了EC球體的延伸次數(shù)和芽入侵距離（圖2F和G）。細(xì)胞富集基因也被VP（圖2H）抑制。因此，可以推斷基質(zhì)硬度調(diào)節(jié)了ECs的細(xì)胞機(jī)械感知和機(jī)械傳輸，促進(jìn)了YAC活化，最終增強(qiáng)了細(xì)胞的形成。

圖2. 細(xì)胞、莖細(xì)胞和密集細(xì)胞的機(jī)械特性差異。

圖3. FluidFM粘附力檢測(cè)過程示意圖。

在確定了血管生成和細(xì)胞形成中EC亞型之間的機(jī)械差異后，作者探討了ECM剛度通過PXN磷化調(diào)節(jié)細(xì)胞的形成，驗(yàn)證了 p-PXN 在硬 ECM 誘導(dǎo)細(xì)胞規(guī)范中的參與程度，進(jìn)而推斷，通過基質(zhì)硬化強(qiáng)加的細(xì)胞形成需要PXN磷酸化。隨后，作者驗(yàn)證了p-PXN-Rac1-YAP激活在ECM僵硬誘導(dǎo)細(xì)胞形成和血管生成體內(nèi)的作用，研究人員通過在裸鼠體內(nèi)皮下注射 HepG2 細(xì)胞創(chuàng)建腫瘤模型，并從第 8 天起每天使用 VP 治療一次（圖4F）。4周后，在腫瘤膠囊（圖4G）上發(fā)現(xiàn)發(fā)芽較少的血管，CD31、CD34和VEGF強(qiáng)度（圖4H，圖4I ）。VP治療減少腫瘤體積（圖4J）。這些數(shù)據(jù)表明p-PXN-Rac1-YAP信號(hào)軸與ECM硬化促進(jìn)的細(xì)胞形成和血管生成有很大關(guān)系。

圖4. p-PXN-Rac1 通過激活 YAP 促進(jìn)細(xì)胞的形成和血管生成。

圖5. 發(fā)芽血管生成受ECM硬度影響的潛在機(jī)制的示意圖。

綜上，基質(zhì)的硬度增加可以顯著增加血管的生長、發(fā)芽和細(xì)胞富集基因的表達(dá)。硬度較大的基質(zhì)增加了FAK和p-PXN在局灶黏附，提高了活性Rac1的水平，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞剛度增加。隨后，YAP作為下游的力效應(yīng)因子被激活并易位入核，上調(diào)靶基因的表達(dá)，最終促進(jìn)細(xì)胞的形成。

【研究意義】

本研究加深了我們對(duì)細(xì)胞形成和血管生成機(jī)理的理解，有助于優(yōu)化組織工程和再生醫(yī)學(xué)的生物材料設(shè)計(jì)，為一些病理情況提供新的治療策略。無論是組織工程還是血管再生，都應(yīng)考慮機(jī)械特性，如針對(duì)細(xì)胞形成的剛度，以設(shè)計(jì)最佳功能生物材料。此外，ECM可以在許多病理狀態(tài)下變硬，如癌癥的發(fā)展過程，隨著變硬癌周圍細(xì)胞數(shù)量的增加，迫切需要靶向p-PXN、Rac1或YAP的藥物來有效防止腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

【研究利器】——FluidFM技術(shù)在生物活性材料領(lǐng)域的創(chuàng)新應(yīng)用

本實(shí)驗(yàn)研究人員采用了多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)——FluidFM技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞的分離，單個(gè)細(xì)胞粘附力的測(cè)量。瑞士Cytosurge公司多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)——FluidFM，是集原子力系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)為一體的單細(xì)胞操作系統(tǒng)。主要功能包括單細(xì)胞注射、單細(xì)胞提取、單細(xì)胞分離、單細(xì)胞粘附力的測(cè)定、生物3D打印等。實(shí)驗(yàn)中FluidFM探針以3 μm/s靠近細(xì)胞，設(shè)定力為100 nN。當(dāng)探針連接到到達(dá)設(shè)定點(diǎn)的細(xì)胞時(shí)，在探針中施加-650 mbar 的力，并保持5 s，以確保細(xì)胞被探針完全抓取。然后，在保持-650 mbar的壓力，以1 μm/s的速度將探針抬高至100 μm的高度，從而將細(xì)胞從基板上完全分離。FluidFM系統(tǒng)完全記錄了每個(gè)單細(xì)胞的Z軸高度和力距離曲線，并分析其粘附強(qiáng)度。每個(gè)條件下至少測(cè)量并獲得20個(gè)力距離曲線。所有細(xì)胞粘附測(cè)量實(shí)驗(yàn)過程都是在 37 °C在5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行。

圖6. FluidFM進(jìn)行單細(xì)胞分離示意圖。
 

圖7. FluidFM進(jìn)行單細(xì)胞力譜測(cè)定示意圖。

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【參考文獻(xiàn)】

[1] Y. Guo, F. Mei, Y. Huang, S. Ma, Y. Wei, X. Zhang, M. Xu, Y. He, B.C. Heng, L. Chen & X. Deng. Matrix stiffness modulates tip cell formation through the p-PXN-Rac1-YAP signaling axis. (2021) Bioactive Materials.

【相關(guān)產(chǎn)品】

多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)-FluidFM OMNIUM