G 蛋白偶聯(lián)受體與小分子化合物的相互作用
化學遺傳學 (Chemogenetics) 是指一種蛋白被改造與先前未被識別的小分子化合物相互作用的過程。多種蛋白的改造已被報道，包括激酶、非激酶的酶類、G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCRs) 和配體門控離子通道�；瘜W遺傳學技術 DREADDs (Designer receptors exclusively activated by designer drugs) 被廣泛應用于神經(jīng)科學中，并被稱為通過 G 蛋白信號通路選擇性操作細胞活力的生物學“鎖和鑰匙” (Lock-and-key) 系統(tǒng)。
經(jīng)典的 GPCR 信號轉(zhuǎn)導依賴于受體介導的異源三聚體 G 蛋白的激活。異源三聚體 G 蛋白由 Gα、Gβ 和 Gγ 三個亞基組成，其中 Gα 亞基可以與鳥苷二磷酸 (GDP) 結合，具有 GTP 水解酶活性。當 G 蛋白處于非活化態(tài)時，為異三聚體，Gα 亞基與 GDP 結合。經(jīng)典 GPCR 通路活化：
不同類型的 GPCRs 與細胞外各種配體 (胞外第一信使) 結合從而接受外界的信號刺激，然后 GPCRs 被活化。→ → GPCRs 與 G 蛋白結合形成復合體，G 蛋白 Gα 亞基構象發(fā)生改變并排斥 GDP，轉(zhuǎn)而結合 GTP，G 蛋白活化。
→ → G 蛋白再激活其下游的各種效應器，產(chǎn)生細胞內(nèi)的第二信使，如環(huán)磷酸腺苷 (cAMP)、環(huán)鳥苷酸 (cGMP)、肌醇三磷酸 (IP3)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 (PIP2)、Ca2+ 和 NO 等，從而將信號逐級傳遞下去，最終細胞響應各類刺激產(chǎn)生不同的興奮性變化。
非經(jīng)典的 GPCR 信號轉(zhuǎn)導依賴于小 G 蛋白 (Small G proteins) 的激活，小 G 蛋白通常是由大約 200 個氨基酸組成的單一多肽，同樣具有 GTP 水解酶活性。
GPCRs 廣泛分布于各個組織器官，其內(nèi)源性和外源性配體、細胞功的多樣性，以及 G 蛋白家族的復雜多樣，都使得體內(nèi)特定 GPCR 信號通路的探究之路困難重重。DREADDs 這時候就出場啦~
1998 年，Coward 等人創(chuàng)造了一種突變的 KOR，并命名為 Ro1 和 Ro2，Ro1 和 Ro2 對天然的 Opioid peptides 配體不敏感，但對合成的KOR激動劑有反應。此后，更多的 GPCRs 被改造，成功的應用于特定的 GPCR 信號通路的體內(nèi)研究。被改造的 GPCRs 稱為 RASSLs，這一方法則被稱為 RASSLs 技術，可以作為簡化 GPCR 信號通路復雜性的工具。不過 RASSLs 技術仍然存在一些局限：
1. 其配體對天然受體具有明顯的親和力和效力 (非選擇性活性)，限制了RASSLs在體內(nèi)的應用；2. 缺少體內(nèi)高效力配體；3. 合成配體可能與其他蛋白靶點有親和力；4. 許多 RASSLs 受體在體內(nèi)有高基礎信號，會掩蓋合成配體誘導的表型。
Pei Y 等人在 2008 年正式提出了使用 DREADDs 技術克服 RASSLs 技術的局限性。DREADDs 與 RASSLs 技術原理相同，兩者都是將不同的 GPCRs 進行改造，使改造后 GPCRs 只接受外源性的人工合成配體的信號，并激活相應的 GPCR 信號通路，從而引發(fā)細胞不同的變化。RASSLs 受體大多是單突變體，對于一些天然配體仍然有反應，DREADDs 則對天然配體無反應。
常見的 DREADDs 受體包括 hM3Dq 、hM4Di 和 GsD (引起 Gs 相關信號通路激活) 均是雙位點突變，對天然配體無反應，這降低了體內(nèi)基礎信號產(chǎn)生的幾率。
PS：此前 Blaine N. Armbruster 等人鑒定出人毒蕈堿乙酰膽堿受體 (mAChR) 3 亞型的雙突變體 (Y149C3.33/A239G5.46)，即 hM3Dq，以及 4 亞型的雙突變體 (Y149C3.33/A239G5.46)，即 hM4Di。hM3Dq 和 hM4Di 對天然配體乙酰膽堿 (Ach) 無反應，但是可以被小分子疊氮平-N-氧化物 (CNO) 激活。hM3Dq 被 CNO 激活時引起 Gαq 相關信號通路的激活，hM4Di 被 CNO 激活時能有效抑制 cAMP 的產(chǎn)生，激活 Gi 相關信號通路。
CNO 與 DREADDs 受體的親和力也更高，可以作為高效配體在各類動物體內(nèi)廣泛應用。此外，CNO 具有類似藥物的特性，但在藥理學上是惰性的，缺乏明顯的脫靶作用，這也減少了合成配體與其他蛋白質(zhì)靶點結合的可能性。
1、選定并改造合適的 DREADDs 受體；
2、通過轉(zhuǎn)基因動物或病毒載體，將 DREADDs 受體基因?qū)雱游矬w內(nèi)。目前已開發(fā)出攜帶 DREADDs 受體轉(zhuǎn)基因的重組腺相關病毒 (AAV) 載體，通過添加細胞特異性啟動子，配合立體定位注射的方法，實現(xiàn) DREADD 受體基因在不同組織細胞內(nèi)的精準表達。如果使用 Cre-Lox P 的條件性基因敲除動物可進一步實現(xiàn)基因的條件可控性表達；
3、對動物進行 CNO 給藥 (控制時間或劑量)；
4、DREADDs 受體的有效性的檢測和動物表型檢測。
盡管 DREADDs 技術早已成為研究動物神經(jīng)元調(diào)節(jié)的強有力工具，但由于 CNO 具有較差的腦外顯率，并且通過代謝降解會產(chǎn)生抗精神病藥物氯氮平 (Clozapine)，這些特性限制了 DREADDs 技術在臨床醫(yī)學上應用。隨著新技術的不斷涌現(xiàn)，將 DREADDs 技術和正電子發(fā)射計算機斷層顯像技術 (PET) 結合，使 DREADDs 技術在更為廣泛的平臺使用成為現(xiàn)實。
2019 年，美國國立藥物濫用研究所 Jordi Bonaventura 等人的一項研究首次將 PET 技術與 DREADDs 技術相結合。研究團隊開發(fā)出了 3 種新型的 DREADDs 配體 JHU37152、JHU37160 和 [18F]JHU37107。這幾種配體都是 DREADDs 受體的強激動劑，具有出色的大腦滲透能力，并且不會轉(zhuǎn)化為氯氮平，其中，[18F]JHU37107 放射化學結構最為穩(wěn)定，可以用作特異性的 PET 放射性示蹤劑，在小鼠、大鼠和恒河猴體內(nèi)對局部定位的神經(jīng)元及其遠程投射成功地進行了 DREADDs 檢測，從而實現(xiàn)無創(chuàng)性神經(jīng)元投射標測。DREADDs 技術和 PET 成像技術結合的關鍵在于開發(fā)新型高效的且有穩(wěn)定放射化學結構的 DREADDs 配體。
總結：GPCRs 參與復雜多樣的細胞信號傳導，是目前最有潛力的藥物靶點之一。然而，GPCRs 的復雜性和多樣性給這些受體的研究帶來了極大的挑戰(zhàn)。DREADDs 技術的出現(xiàn)為人工控制 GPCR 介導的信號轉(zhuǎn)導和揭示特定生理事件背后的機制提供了強有力的工具。近年，DREADDs 技術與 PET 技術的結合更是擴大了該技術的適用范圍。相信未來 DREADDs 技術還會在更多領域發(fā)揮作用。
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縮寫
Κ opioid receptor, KOR
RASSLs: Receptors activated solely by synthetic ligands
mAChR: Human muscarinic acetylcholine receptor
Ach: Acetylcholine
CNO: Clozapine-N-oxide
PET: Positron Emission Computed Tomography
參考文獻
1. Hilger D, Masureel M, Kobilka BK. Structure and dynamics of GPCR signaling complexes. Nat Struct Mol Biol. 2018 Jan;25(1):4-12.
2. Simon MI, Strathmann MP, Gautam N. Diversity of G proteins in signal transduction. Science. 1991 May 10;252(5007):802-8.
3. Hermans E. Biochemical and pharmacological control of the multiplicity of coupling at G-protein-coupled receptors. Pharmacol Ther. 2003 Jul;99(1):25-44.
4. Strader CD, Gaffney T, Sugg EE, Candelore MR, Keys R. et al. Allele-specific activation of genetically engineered receptors. J Biol Chem 266: 5–8, 1991.
5. Coward P, Wada HG, Falk MS, Chan SD.et al. Controlling signaling with a specifically designed Gi-coupled receptor. Proc Natl Acad Sci USA 95: 352–357, 1998.
6. Sweger EJ, Casper KB, Scearce-Levie K, Conklin BR, McCarthy KD. Development of hydrocephalus in mice expressing the G(i)-coupled GPCR Ro1 RASSL receptor in astrocytes. J Neurosci 27:2309–2317, 2007.
7. Pei Y, Rogan SC, Yan F, Roth BL. Engineered GPCRs as tools to modulate signal transduction. Physiology (Bethesda). 2008 Dec;23:313-21.
8. Armbruster BN, Li X, Pausch MH, Herlitze S, Roth BL. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Mar 20;104(12):5163-8.
9. Ardizzone TD, Bradley RJ, Freeman AM 3rd, Dwyer DS. Inhibition of glucose transport in PC12 cells by the atypical antipsychotic drugs risperidone and clozapine, and structural analogs of clozapine. Brain Res. 2001 Dec 27;923(1-2):82-90.
10. Bockaert J, Pin JP. Molecular tinkering of G protein-coupled receptors: an evolutionary success. EMBO J. 1999 Apr 1;18(7):1723-9.
11. Bonaventura J, Eldridge MAG, Hu F, Gomez JL, Sanchez-Soto M, Abramyan AM. et al. High-potency ligands for DREADD imaging and activation in rodents and monkeys. Nat Commun. 2019 Oct 11;10(1):4627
G 蛋白偶聯(lián)受體
G 蛋白偶聯(lián)受體 (G-protein-coupled receptors, GPCRs) 是人類基因組中最大的蛋白質(zhì)超家族。GPCRs 是一大類七次跨膜的受體蛋白，通過與 G 蛋白偶聯(lián)，隨后調(diào)節(jié)多種細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應，以響應激素、神經(jīng)遞質(zhì)、離子、光、氣味、趨化因子和其他刺激 ，參與了眾多生理過程包括感光、嗅覺、行為和情緒的調(diào)節(jié)、自主神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等。GPCRs 在生理學和疾病中扮演著重要的角色，是非常有吸引力的藥物靶點。經(jīng)典的 GPCR 信號轉(zhuǎn)導依賴于受體介導的異源三聚體 G 蛋白的激活。異源三聚體 G 蛋白由 Gα、Gβ 和 Gγ 三個亞基組成，其中 Gα 亞基可以與鳥苷二磷酸 (GDP) 結合，具有 GTP 水解酶活性。當 G 蛋白處于非活化態(tài)時，為異三聚體，Gα 亞基與 GDP 結合。經(jīng)典 GPCR 通路活化：
不同類型的 GPCRs 與細胞外各種配體 (胞外第一信使) 結合從而接受外界的信號刺激，然后 GPCRs 被活化。→ → GPCRs 與 G 蛋白結合形成復合體，G 蛋白 Gα 亞基構象發(fā)生改變并排斥 GDP，轉(zhuǎn)而結合 GTP，G 蛋白活化。
→ → G 蛋白再激活其下游的各種效應器，產(chǎn)生細胞內(nèi)的第二信使，如環(huán)磷酸腺苷 (cAMP)、環(huán)鳥苷酸 (cGMP)、肌醇三磷酸 (IP3)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 (PIP2)、Ca2+ 和 NO 等，從而將信號逐級傳遞下去，最終細胞響應各類刺激產(chǎn)生不同的興奮性變化。
圖 1. G 蛋白偶聯(lián)受體的模式圖[10]
非經(jīng)典的 GPCR 信號轉(zhuǎn)導依賴于小 G 蛋白 (Small G proteins) 的激活，小 G 蛋白通常是由大約 200 個氨基酸組成的單一多肽，同樣具有 GTP 水解酶活性。
GPCRs 廣泛分布于各個組織器官，其內(nèi)源性和外源性配體、細胞功的多樣性，以及 G 蛋白家族的復雜多樣，都使得體內(nèi)特定 GPCR 信號通路的探究之路困難重重。DREADDs 這時候就出場啦~
DREADDs 技術的降生
1991 年，Strader 等人首次嘗試改造 GPCRs，然后使用外源性的人工合成配體激活改造后的 GPCRs，激活特定的 GPCR 信號通路�？上У氖�，他們使用的合成配體的效力太低，無法用于進一步的體內(nèi)研究。1998 年，Coward 等人創(chuàng)造了一種突變的 KOR，并命名為 Ro1 和 Ro2，Ro1 和 Ro2 對天然的 Opioid peptides 配體不敏感，但對合成的KOR激動劑有反應。此后，更多的 GPCRs 被改造，成功的應用于特定的 GPCR 信號通路的體內(nèi)研究。被改造的 GPCRs 稱為 RASSLs，這一方法則被稱為 RASSLs 技術，可以作為簡化 GPCR 信號通路復雜性的工具。不過 RASSLs 技術仍然存在一些局限：
1. 其配體對天然受體具有明顯的親和力和效力 (非選擇性活性)，限制了RASSLs在體內(nèi)的應用；2. 缺少體內(nèi)高效力配體；3. 合成配體可能與其他蛋白靶點有親和力；4. 許多 RASSLs 受體在體內(nèi)有高基礎信號，會掩蓋合成配體誘導的表型。
Pei Y 等人在 2008 年正式提出了使用 DREADDs 技術克服 RASSLs 技術的局限性。DREADDs 與 RASSLs 技術原理相同，兩者都是將不同的 GPCRs 進行改造，使改造后 GPCRs 只接受外源性的人工合成配體的信號，并激活相應的 GPCR 信號通路，從而引發(fā)細胞不同的變化。RASSLs 受體大多是單突變體，對于一些天然配體仍然有反應，DREADDs 則對天然配體無反應。
常見的 DREADDs 受體包括 hM3Dq 、hM4Di 和 GsD (引起 Gs 相關信號通路激活) 均是雙位點突變，對天然配體無反應，這降低了體內(nèi)基礎信號產(chǎn)生的幾率。
PS：此前 Blaine N. Armbruster 等人鑒定出人毒蕈堿乙酰膽堿受體 (mAChR) 3 亞型的雙突變體 (Y149C3.33/A239G5.46)，即 hM3Dq，以及 4 亞型的雙突變體 (Y149C3.33/A239G5.46)，即 hM4Di。hM3Dq 和 hM4Di 對天然配體乙酰膽堿 (Ach) 無反應，但是可以被小分子疊氮平-N-氧化物 (CNO) 激活。hM3Dq 被 CNO 激活時引起 Gαq 相關信號通路的激活，hM4Di 被 CNO 激活時能有效抑制 cAMP 的產(chǎn)生，激活 Gi 相關信號通路。
圖 2. hM3Dq 和 hM4Di 受體結構示意圖
CNO 與 DREADDs 受體的親和力也更高，可以作為高效配體在各類動物體內(nèi)廣泛應用。此外，CNO 具有類似藥物的特性，但在藥理學上是惰性的，缺乏明顯的脫靶作用，這也減少了合成配體與其他蛋白質(zhì)靶點結合的可能性。
DREADDs 技術的現(xiàn)狀
目前，DREADDs 技術廣泛用于神經(jīng)元的相關研究，操作步驟可以概括如下：1、選定并改造合適的 DREADDs 受體；
2、通過轉(zhuǎn)基因動物或病毒載體，將 DREADDs 受體基因?qū)雱游矬w內(nèi)。目前已開發(fā)出攜帶 DREADDs 受體轉(zhuǎn)基因的重組腺相關病毒 (AAV) 載體，通過添加細胞特異性啟動子，配合立體定位注射的方法，實現(xiàn) DREADD 受體基因在不同組織細胞內(nèi)的精準表達。如果使用 Cre-Lox P 的條件性基因敲除動物可進一步實現(xiàn)基因的條件可控性表達；
3、對動物進行 CNO 給藥 (控制時間或劑量)；
4、DREADDs 受體的有效性的檢測和動物表型檢測。
盡管 DREADDs 技術早已成為研究動物神經(jīng)元調(diào)節(jié)的強有力工具，但由于 CNO 具有較差的腦外顯率，并且通過代謝降解會產(chǎn)生抗精神病藥物氯氮平 (Clozapine)，這些特性限制了 DREADDs 技術在臨床醫(yī)學上應用。隨著新技術的不斷涌現(xiàn)，將 DREADDs 技術和正電子發(fā)射計算機斷層顯像技術 (PET) 結合，使 DREADDs 技術在更為廣泛的平臺使用成為現(xiàn)實。
2019 年，美國國立藥物濫用研究所 Jordi Bonaventura 等人的一項研究首次將 PET 技術與 DREADDs 技術相結合。研究團隊開發(fā)出了 3 種新型的 DREADDs 配體 JHU37152、JHU37160 和 [18F]JHU37107。這幾種配體都是 DREADDs 受體的強激動劑，具有出色的大腦滲透能力，并且不會轉(zhuǎn)化為氯氮平，其中，[18F]JHU37107 放射化學結構最為穩(wěn)定，可以用作特異性的 PET 放射性示蹤劑，在小鼠、大鼠和恒河猴體內(nèi)對局部定位的神經(jīng)元及其遠程投射成功地進行了 DREADDs 檢測，從而實現(xiàn)無創(chuàng)性神經(jīng)元投射標測。DREADDs 技術和 PET 成像技術結合的關鍵在于開發(fā)新型高效的且有穩(wěn)定放射化學結構的 DREADDs 配體。
圖 3. PET 放射性配體 [18F]JHU37107 在局部靶向 DREADDs 作用[11]
a. [18F]JHU37107 的結構；b. [18F]JHU37107 與轉(zhuǎn)基因 D1-DREADD 小鼠大腦中的 DREADDs 結合；c. [18F]JHU37107 與大鼠皮層中表達的 AAV-DREADDs 結合；d. [18F]JHU37107 與猴子杏仁核中表達的 hM4Di 結合。
a. [18F]JHU37107 的結構；b. [18F]JHU37107 與轉(zhuǎn)基因 D1-DREADD 小鼠大腦中的 DREADDs 結合；c. [18F]JHU37107 與大鼠皮層中表達的 AAV-DREADDs 結合；d. [18F]JHU37107 與猴子杏仁核中表達的 hM4Di 結合。
總結：GPCRs 參與復雜多樣的細胞信號傳導，是目前最有潛力的藥物靶點之一。然而，GPCRs 的復雜性和多樣性給這些受體的研究帶來了極大的挑戰(zhàn)。DREADDs 技術的出現(xiàn)為人工控制 GPCR 介導的信號轉(zhuǎn)導和揭示特定生理事件背后的機制提供了強有力的工具。近年，DREADDs 技術與 PET 技術的結合更是擴大了該技術的適用范圍。相信未來 DREADDs 技術還會在更多領域發(fā)揮作用。
| 相關產(chǎn)品 |
| Cyclic AMP 細胞內(nèi)的第二信使，由于某些激素或其它分子信號刺激激活腺苷酸環(huán)化酶。 |
| Clozapine-N-oxide DREADDs 受體的配體，可以激活 DREADD 受體 hM3Dq 和 hM4Di。 |
| Clozapine 毒蕈堿乙酰膽堿受體 M1 受體的拮抗劑和 M4 受體的激動劑，可用于抗精神分裂癥的研究。 |
| Acetylcholine chloride 一種神經(jīng)遞質(zhì)，通過刺激 nAChRs，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活性。 |
| GPCR/G 蛋白化合物庫 收錄了 1400+ 種靶向 GPCRs 的小分子化合物，可以用于 GPCR 相關的不同研究及藥物開發(fā)篩選。 |
| 神經(jīng)信號化合物庫 收錄了 1400+ 種神經(jīng)信號相關的小分子化合物，可以用于研究神經(jīng)調(diào)控及神經(jīng)疾病。 |
縮寫
Κ opioid receptor, KOR
RASSLs: Receptors activated solely by synthetic ligands
mAChR: Human muscarinic acetylcholine receptor
Ach: Acetylcholine
CNO: Clozapine-N-oxide
PET: Positron Emission Computed Tomography
參考文獻
1. Hilger D, Masureel M, Kobilka BK. Structure and dynamics of GPCR signaling complexes. Nat Struct Mol Biol. 2018 Jan;25(1):4-12.
2. Simon MI, Strathmann MP, Gautam N. Diversity of G proteins in signal transduction. Science. 1991 May 10;252(5007):802-8.
3. Hermans E. Biochemical and pharmacological control of the multiplicity of coupling at G-protein-coupled receptors. Pharmacol Ther. 2003 Jul;99(1):25-44.
4. Strader CD, Gaffney T, Sugg EE, Candelore MR, Keys R. et al. Allele-specific activation of genetically engineered receptors. J Biol Chem 266: 5–8, 1991.
5. Coward P, Wada HG, Falk MS, Chan SD.et al. Controlling signaling with a specifically designed Gi-coupled receptor. Proc Natl Acad Sci USA 95: 352–357, 1998.
6. Sweger EJ, Casper KB, Scearce-Levie K, Conklin BR, McCarthy KD. Development of hydrocephalus in mice expressing the G(i)-coupled GPCR Ro1 RASSL receptor in astrocytes. J Neurosci 27:2309–2317, 2007.
7. Pei Y, Rogan SC, Yan F, Roth BL. Engineered GPCRs as tools to modulate signal transduction. Physiology (Bethesda). 2008 Dec;23:313-21.
8. Armbruster BN, Li X, Pausch MH, Herlitze S, Roth BL. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Mar 20;104(12):5163-8.
9. Ardizzone TD, Bradley RJ, Freeman AM 3rd, Dwyer DS. Inhibition of glucose transport in PC12 cells by the atypical antipsychotic drugs risperidone and clozapine, and structural analogs of clozapine. Brain Res. 2001 Dec 27;923(1-2):82-90.
10. Bockaert J, Pin JP. Molecular tinkering of G protein-coupled receptors: an evolutionary success. EMBO J. 1999 Apr 1;18(7):1723-9.
11. Bonaventura J, Eldridge MAG, Hu F, Gomez JL, Sanchez-Soto M, Abramyan AM. et al. High-potency ligands for DREADD imaging and activation in rodents and monkeys. Nat Commun. 2019 Oct 11;10(1):4627
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