類器官、單細胞分析技術(shù)和MAPK信號通路在腫瘤監(jiān)測的應用
聽說“類器官”和“單細胞分析”技術(shù)比較火，小編也來湊個熱鬧。最近，Nature Cell Biology 刊登的題為 Quantifying single-cell ERK dynamics in colorectal cancer organoids reveals EGFR as an amplifier of oncogenic MAPK pathway signaling 的研究，作者團隊通過 ERK 生物傳感器 EKAREN5 監(jiān)測結(jié)腸直腸癌 (CRC) 類器官中的單細胞 ERK 水平動態(tài)變化，揭示了有致癌突變的 MAPK 通路信號中，上游的 EGFR 是關(guān)鍵的信號放大因子。該研究用到了類器官和單細胞分析技術(shù)，還涉及了 MAPK 這條復雜的信號通路。
類器官 (Organoids) 技術(shù)：類器官是細胞衍生的體外 3D 器官模型，可在模擬內(nèi)源性細胞組織和器官結(jié)構(gòu)的環(huán)境中研究生物學過程，例如細胞行為、組織修復以及對藥物或突變的反應。重要的是，3D 體外模型保留了體內(nèi)腫瘤的組織病理學特征，包括患者特異性藥物反應。類器官是一項重大技術(shù)突破，在藥物篩選、疾病建模、基因編輯和移植方向的應用都表現(xiàn)出巨大的潛力。
單細胞分析：隨著生物學研究的不斷深入，細胞間異質(zhì)性的探討是必然的趨勢，因此，在單細胞水平上基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學和細胞間相互作用的研究越來越重要，單細胞分析如單細胞測序技術(shù)、單細胞免疫印跡技術(shù)等成了必不可少的研究手段。
MAPK 信號通路十分復雜，由于正、負反饋的存在，下游 ERK 信號動力學表現(xiàn)出振蕩 (Oscillatory) 特質(zhì)，即脈沖波動。單細胞 ERK 動態(tài)監(jiān)測腫瘤組織的藥物反應有助于我們對靶向治療反應的認知。而KRAS 或 BRAF 突變 CRC 腫瘤中， EGFR 傳導的信號和 KRAS 和 BRAF 突變兩者誘導的 ERK 活化動力學仍有疑問，例如兩者誰起核心作用，為了探究這個問題，Hugo J. G. Snippert 教授的團隊用 ERK 生物傳感器檢測 CRC 類器官中的單細胞 ERK 活性。
■ 監(jiān)測 CRC PDOs 中單細胞 ERK 的藥物應答
為了了解具有突變的 MAPK 途徑的人類腫瘤中的藥物反應，作者團隊重新設計了 ERK 生物傳感器 EKAREN5 來捕獲 CRC PDOs 中單細胞 ERK 圖譜的動態(tài)性質(zhì)。
首先，作者團隊建立了 MAPK 通路中包含致癌突變的類器官 PDO-KRASG12C、PDO-KRASG12V、PDO-KRASG12D、PDO-NRASQ61H 和 PDO-BRAFV600E 以及 MAPK 通路中沒有突變的類器官。并通過 MEK 抑制劑 (Selumetinib) 、ERK 抑制劑 (SCH772984) 以及 PMA 和 大田軟海綿酸 (Okadaic acid) 對傳感器進行單細胞 ERK 活性標準化，便于進行 PDO 品系之間比較分析。
監(jiān)測 PDO-KRASG12V 中 MEK 抑制劑 Selumetinib 藥物應答，在處理前，幾乎所有細胞都表現(xiàn)出廣泛的 ERK 自主波動，類似于在健康小鼠小腸類器官中觀察到的波動，揭示了野生型/突變型 MAPK 信號傳導的 CRC PDOs 廣泛存在 ERK 活性振蕩。Selumetinib 處理后，ERK 信號受到抑制，值得注意的是，Selumetinib 處理 2 小時后，發(fā)現(xiàn)有少量細胞發(fā)生 ERK 重激活，比之前報道的細胞培養(yǎng)中 ERK 的重激活要快很多，高濃度的 Selumetinib 處理，重激活的頻率和幅度下降。有趣的是，ERK 的重激活顯示出細胞之間的異質(zhì)性，即使相鄰細胞之間也存在顯著差異。同樣的，pan-RAF 抑制劑 LY3009120 處理的 PDO-BRAFV600 中同樣觀察到了細胞間異質(zhì)性。
■ PDOs 中 HER 的抑制消除了 ERK 活性振蕩
在 PDO-KRASG12V 中抑制上游 EGFR 后監(jiān)測 ERK 活性動態(tài)。盡管下游存在突變的 KRAS，低濃度的 pan-HER 抑制劑阿法替尼 (Afatinib) 處理仍能立即并大幅度抑制 ERK 活性的波動，pan-HER 抑制劑(Lapatinib、Dacometinib) 以及 EGFR 特異性抑制劑 (Gefitinib、Erlotinib、Cetuximab) 同樣抑制了 ERK 活性波動，而 HER2 特異性抑制劑 CP-724714 則沒有。在其他突變和野生型類器官中也觀察到了 Afatinib 誘導的 ERK 活性波動消除。這些數(shù)據(jù)表明，盡管在 KRAS 或 BRAF 中有致癌性突變，EGFR 仍然是人類 CRC 腫瘤細胞中 ERK 活性的主要驅(qū)動力。
值得注意的是，殘余的 ERK 活性在抑制上游信號后變得很明顯，缺乏振蕩特性，很可能反映的是突變 RAS 或 RAF 的構(gòu)成的致癌信號。
通過 LY3009120 處理 RAS 突變型 PDOs，細胞中上游鳥苷酸交換因子 (GEFs) 結(jié)構(gòu)域失常，以及 AMG-510 (KRASG12C 選擇性抑制劑) 處理降低的 PDO-KRASG12C，結(jié)果表明 EGFR 持續(xù)參與突變型 MAPK 信號傳導，突變的 KRAS 分子參與 EGFR 介導的 ERK 活化。因此，ERK 活性驅(qū)動由來源于致癌基因的有限的基礎(chǔ)信號，加上大很多的 EGFR 驅(qū)動的脈沖信號組成。
■ PDOs 對 EGF 長期剝奪條件的適應
長期剝奪 EGF 的情況下，所有 RAS 突變 PDOs 的 ERK 自主波動譜在很大程度上未發(fā)生變化，而總體 ERK 磷酸化狀態(tài)僅輕微降低。RAS 突變體中 ERK 波動對 Afatinib 敏感，其中BRAF 突變體與 RAS 突變體的反應，但最終結(jié)果表明這些 PDOs 建立了自分泌和/或旁分泌的 EGFR 刺激。盡管限制了 EGF，大多數(shù) CRC PDOs 仍保持 ERK 活性振蕩模式，可能是旁分泌或微環(huán)境衍生的 EGFR 刺激物仍可以支持致癌 MAPK 信號放大，從而促進腫瘤生長，這點也與多種 CRC 的 PDX 模型推論結(jié)果一致。因此，EGFR 的抑制對抑制致癌 MAPK 信號必不可少。
■ 體內(nèi)外 EGFR 介導的信號放大促進腫瘤生長
長時間的泛 HER 抑制劑抑制了突變型 PDOs 中 EGFR 驅(qū)動的 ERK 水平振蕩，降低了突變型 PDOs 的生長水平，但不影響其存活，而 EGFR 的信號放大作用則促進細胞增殖。有趣的是，將 Afatinib 與 LY3009120 聯(lián)合使用可消除致癌基因驅(qū)動的 ERK 活性，從而導致 PDO-KRASG12C 死亡率增加。
最后，他們通過 PDX 小鼠模型 (人源腫瘤異體移植模型) 中驗證，得到了相同的結(jié)論：EGFR 的激活放大了下游致癌 MAPK 效應因子的信號傳導。
總結(jié)：
靶向 KRAS 或 BRAF 突變 CRC 需要“垂直靶向”包括多個效應因子，包括上游的 EGFR，其負反饋激活是抑制下游后產(chǎn)生耐藥性的機制�？偟膩碚f，該實驗通過類器官中單細胞 ERK 水平的動態(tài)監(jiān)測，揭示了 EGFR 信號放大了致癌 MAPK 效應因子 (如 RAS，BRAF) 的信號傳導，為以上的概念提供了有力的理論支持。
值得一提的是，該研究應用 PDO 技術(shù)是體外穩(wěn)健的 3D 技術(shù)，它保留了體內(nèi)腫瘤的病理學特征，包括患者特異性藥物反應，對臨床前藥物篩選、個性化藥物和藥物開發(fā)具有重要意義，它與 PDX 有同樣的臨床關(guān)聯(lián)性，并兼具活細胞成像的即時細胞藥物反應。因此，研究證明了通過藥理性靶向 EGFR 來抑制信號放大過程，是 MAPK 突變 CRC 靶向治療的重要一步。
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縮寫
PSCs: either pluripotent stem cells
ASCs: multipotent organ-specific adult stem cells
MAPK：The mitogen-activated protein kinase
ERK：Extracellular-regulated kinase
EGFR：Epidermal growth factor receptor
PDOs：Patient-derived organoids
FRET：fluorescence resonance energy transfer
參考文獻
1. Bas Ponsioen, Hugo J. G. Snippert, et al. Quantifying single-cell ERK dynamics in colorectal cancer organoids reveals EGFR as an amplifier of oncogenic MAPK pathway signaling. Nat Cell Biol. 2021 Apr;23(4):377-390.
2. Kai Kretzschmar, Hans Clevers. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Dev Cell. 2016 Sep 26;38(6):590-600.
3. Frans Schutgens, Hans Clevers.Human Organoids: Tools for Understanding Biology and Treating Diseases. Annu Rev Pathol. 2020 Jan 24;15:211-234
類器官 (Organoids) 技術(shù)：類器官是細胞衍生的體外 3D 器官模型，可在模擬內(nèi)源性細胞組織和器官結(jié)構(gòu)的環(huán)境中研究生物學過程，例如細胞行為、組織修復以及對藥物或突變的反應。重要的是，3D 體外模型保留了體內(nèi)腫瘤的組織病理學特征，包括患者特異性藥物反應。類器官是一項重大技術(shù)突破，在藥物篩選、疾病建模、基因編輯和移植方向的應用都表現(xiàn)出巨大的潛力。
圖 1. 類器官被 Nature Methods 選為 2017 年度最佳方法[一般類器官的建立：多能干細胞 (PSC/ASCs) 或切碎的組織塊在含有細胞外基質(zhì) (小腸上皮類器官建立可用 Lgr5+ 干細胞代替) 和相應器官生長需要的生長因子的 3D 培養(yǎng)基，即組織特異性的生長微環(huán)境中培養(yǎng)，驅(qū)動干細胞形成類器官的組織結(jié)構(gòu)。目前已經(jīng)有多種建立類器官的方法，科研人員已經(jīng)成功建立了腸道、大腦、胃、肝等多種不同組織的類器官。]
單細胞分析：隨著生物學研究的不斷深入，細胞間異質(zhì)性的探討是必然的趨勢，因此，在單細胞水平上基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學和細胞間相互作用的研究越來越重要，單細胞分析如單細胞測序技術(shù)、單細胞免疫印跡技術(shù)等成了必不可少的研究手段。
圖 2. pan-HER 抑制劑 Afatinib 作用于 MAPK 信號通路
MAPK 信號通路十分復雜，由于正、負反饋的存在，下游 ERK 信號動力學表現(xiàn)出振蕩 (Oscillatory) 特質(zhì)，即脈沖波動。單細胞 ERK 動態(tài)監(jiān)測腫瘤組織的藥物反應有助于我們對靶向治療反應的認知。而KRAS 或 BRAF 突變 CRC 腫瘤中， EGFR 傳導的信號和 KRAS 和 BRAF 突變兩者誘導的 ERK 活化動力學仍有疑問，例如兩者誰起核心作用，為了探究這個問題，Hugo J. G. Snippert 教授的團隊用 ERK 生物傳感器檢測 CRC 類器官中的單細胞 ERK 活性。
■ 監(jiān)測 CRC PDOs 中單細胞 ERK 的藥物應答
為了了解具有突變的 MAPK 途徑的人類腫瘤中的藥物反應，作者團隊重新設計了 ERK 生物傳感器 EKAREN5 來捕獲 CRC PDOs 中單細胞 ERK 圖譜的動態(tài)性質(zhì)。
首先，作者團隊建立了 MAPK 通路中包含致癌突變的類器官 PDO-KRASG12C、PDO-KRASG12V、PDO-KRASG12D、PDO-NRASQ61H 和 PDO-BRAFV600E 以及 MAPK 通路中沒有突變的類器官。并通過 MEK 抑制劑 (Selumetinib) 、ERK 抑制劑 (SCH772984) 以及 PMA 和 大田軟海綿酸 (Okadaic acid) 對傳感器進行單細胞 ERK 活性標準化，便于進行 PDO 品系之間比較分析。
圖 3. CRC 類器官中單細胞 ERK 動態(tài)揭示了 MAPK 通路抑制劑處理下細胞間具有異質(zhì)性
監(jiān)測 PDO-KRASG12V 中 MEK 抑制劑 Selumetinib 藥物應答，在處理前，幾乎所有細胞都表現(xiàn)出廣泛的 ERK 自主波動，類似于在健康小鼠小腸類器官中觀察到的波動，揭示了野生型/突變型 MAPK 信號傳導的 CRC PDOs 廣泛存在 ERK 活性振蕩。Selumetinib 處理后，ERK 信號受到抑制，值得注意的是，Selumetinib 處理 2 小時后，發(fā)現(xiàn)有少量細胞發(fā)生 ERK 重激活，比之前報道的細胞培養(yǎng)中 ERK 的重激活要快很多，高濃度的 Selumetinib 處理，重激活的頻率和幅度下降。有趣的是，ERK 的重激活顯示出細胞之間的異質(zhì)性，即使相鄰細胞之間也存在顯著差異。同樣的，pan-RAF 抑制劑 LY3009120 處理的 PDO-BRAFV600 中同樣觀察到了細胞間異質(zhì)性。
■ PDOs 中 HER 的抑制消除了 ERK 活性振蕩
在 PDO-KRASG12V 中抑制上游 EGFR 后監(jiān)測 ERK 活性動態(tài)。盡管下游存在突變的 KRAS，低濃度的 pan-HER 抑制劑阿法替尼 (Afatinib) 處理仍能立即并大幅度抑制 ERK 活性的波動，pan-HER 抑制劑(Lapatinib、Dacometinib) 以及 EGFR 特異性抑制劑 (Gefitinib、Erlotinib、Cetuximab) 同樣抑制了 ERK 活性波動，而 HER2 特異性抑制劑 CP-724714 則沒有。在其他突變和野生型類器官中也觀察到了 Afatinib 誘導的 ERK 活性波動消除。這些數(shù)據(jù)表明，盡管在 KRAS 或 BRAF 中有致癌性突變，EGFR 仍然是人類 CRC 腫瘤細胞中 ERK 活性的主要驅(qū)動力。
圖 4. Afatinib 消除了 KRAS、NRAS 或 BRAF 突變 PDOs 中的 ERK 活性波動
值得注意的是，殘余的 ERK 活性在抑制上游信號后變得很明顯，缺乏振蕩特性，很可能反映的是突變 RAS 或 RAF 的構(gòu)成的致癌信號。
通過 LY3009120 處理 RAS 突變型 PDOs，細胞中上游鳥苷酸交換因子 (GEFs) 結(jié)構(gòu)域失常，以及 AMG-510 (KRASG12C 選擇性抑制劑) 處理降低的 PDO-KRASG12C，結(jié)果表明 EGFR 持續(xù)參與突變型 MAPK 信號傳導，突變的 KRAS 分子參與 EGFR 介導的 ERK 活化。因此，ERK 活性驅(qū)動由來源于致癌基因的有限的基礎(chǔ)信號，加上大很多的 EGFR 驅(qū)動的脈沖信號組成。
■ PDOs 對 EGF 長期剝奪條件的適應
長期剝奪 EGF 的情況下，所有 RAS 突變 PDOs 的 ERK 自主波動譜在很大程度上未發(fā)生變化，而總體 ERK 磷酸化狀態(tài)僅輕微降低。RAS 突變體中 ERK 波動對 Afatinib 敏感，其中BRAF 突變體與 RAS 突變體的反應，但最終結(jié)果表明這些 PDOs 建立了自分泌和/或旁分泌的 EGFR 刺激。盡管限制了 EGF，大多數(shù) CRC PDOs 仍保持 ERK 活性振蕩模式，可能是旁分泌或微環(huán)境衍生的 EGFR 刺激物仍可以支持致癌 MAPK 信號放大，從而促進腫瘤生長，這點也與多種 CRC 的 PDX 模型推論結(jié)果一致。因此，EGFR 的抑制對抑制致癌 MAPK 信號必不可少。
圖 5. 長期剝奪 EGF 條件下，突變型 PDOs
■ 體內(nèi)外 EGFR 介導的信號放大促進腫瘤生長
長時間的泛 HER 抑制劑抑制了突變型 PDOs 中 EGFR 驅(qū)動的 ERK 水平振蕩，降低了突變型 PDOs 的生長水平，但不影響其存活，而 EGFR 的信號放大作用則促進細胞增殖。有趣的是，將 Afatinib 與 LY3009120 聯(lián)合使用可消除致癌基因驅(qū)動的 ERK 活性，從而導致 PDO-KRASG12C 死亡率增加。
圖 6. Afatinib+LY3009120 消除了阻止了所有突變型 PDOs 的增殖
最后，他們通過 PDX 小鼠模型 (人源腫瘤異體移植模型) 中驗證，得到了相同的結(jié)論：EGFR 的激活放大了下游致癌 MAPK 效應因子的信號傳導。
總結(jié)：
靶向 KRAS 或 BRAF 突變 CRC 需要“垂直靶向”包括多個效應因子，包括上游的 EGFR，其負反饋激活是抑制下游后產(chǎn)生耐藥性的機制�？偟膩碚f，該實驗通過類器官中單細胞 ERK 水平的動態(tài)監(jiān)測，揭示了 EGFR 信號放大了致癌 MAPK 效應因子 (如 RAS，BRAF) 的信號傳導，為以上的概念提供了有力的理論支持。
值得一提的是，該研究應用 PDO 技術(shù)是體外穩(wěn)健的 3D 技術(shù)，它保留了體內(nèi)腫瘤的病理學特征，包括患者特異性藥物反應，對臨床前藥物篩選、個性化藥物和藥物開發(fā)具有重要意義，它與 PDX 有同樣的臨床關(guān)聯(lián)性，并兼具活細胞成像的即時細胞藥物反應。因此，研究證明了通過藥理性靶向 EGFR 來抑制信號放大過程，是 MAPK 突變 CRC 靶向治療的重要一步。
| 相關(guān)產(chǎn)品 |
| Gefitinib 有效，選擇性和口服活性的 EGFR 酪氨酸激酶抑制劑，IC50 為 33 nM；選擇性抑制 EGF 刺激的腫瘤細胞生長，并阻斷 EGF 刺激的腫瘤細胞中 EGFR 自磷酸化；可誘導細胞自噬 (autophagy)。 |
| Erlotinib 直接作用的 EGFR 酪氨酸激酶抑制劑，對人 EGFR 的 IC50 為 2 nM。Erlotinib 可降低完整腫瘤細胞的 EGFR 自磷酸化，IC50 為 20 nM。 |
| Cetuximab 單克隆抗體，能夠抑制 EGFR，具有高效的抗腫瘤活性。 |
| PD98059 有效的選擇性的 MEK 抑制劑，IC50 為 5 µM。PD98059 與 MEK 的無活性形式結(jié)合，從而阻止上游激酶激活 MEK1 和 MEK2 ； 能有效抑制 ERK1/2 信號。 |
| Ravoxertinib 具有口服活性的 ERK 激酶抑制劑，抑制 ERK1 和 ERK2 的 IC50 分別為 6.1 nM 和 3.1 nM。 |
| Phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) 一種佛波酯，是蛋白激酶 C (PKC) 和 SphK 的激活劑，能通過 PKC 激活 RAF。 |
縮寫
PSCs: either pluripotent stem cells
ASCs: multipotent organ-specific adult stem cells
MAPK：The mitogen-activated protein kinase
ERK：Extracellular-regulated kinase
EGFR：Epidermal growth factor receptor
PDOs：Patient-derived organoids
FRET：fluorescence resonance energy transfer
參考文獻
1. Bas Ponsioen, Hugo J. G. Snippert, et al. Quantifying single-cell ERK dynamics in colorectal cancer organoids reveals EGFR as an amplifier of oncogenic MAPK pathway signaling. Nat Cell Biol. 2021 Apr;23(4):377-390.
2. Kai Kretzschmar, Hans Clevers. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Dev Cell. 2016 Sep 26;38(6):590-600.
3. Frans Schutgens, Hans Clevers.Human Organoids: Tools for Understanding Biology and Treating Diseases. Annu Rev Pathol. 2020 Jan 24;15:211-234
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