亞微米光學光熱紅外技術(shù)O-PTIR的優(yōu)勢和具體案例

拉曼光譜技術(shù)
 

近年來，拉曼光譜和成像技術(shù), 得益于其相對于紅外光譜技術(shù)優(yōu)異的空間分辨率等優(yōu)勢，在研究樣品的分子振動方向得到了廣泛的應用，尤其是生物樣品，因為水中的拉曼光譜背景信號更弱。相干拉曼散射顯微技術(shù)（Coherent Raman scattering microscopy）近些年也得到了大力的發(fā)展，其基于相干反斯托克斯拉曼散射（coherent anti-Stokes Raman scattering）或受激拉曼散射（stimulated Raman scattering），大大改善拉曼的成像速度。例如，蛋白質(zhì)和脂肪在皮膚內(nèi)的分布情況，可以通過兩者在C-H伸縮振動區(qū)特征的拉曼譜帶進行視頻級的高速成像來獲得。
 

然而拉曼光譜和成像技術(shù)也存在著自身的一些不足：

（1）較低的拉曼散射截面，尤其是在指紋區(qū)，相對于紅外技術(shù)弱5-10倍；

（2）會受到熒光的干擾，由于拉曼信號偏弱，一些樣品的熒光信號又寬又強，會一定程度上覆蓋拉曼信號；
 

光學光熱紅外技術(shù)
 

基于光學-光熱紅外技術(shù)(O-PTIR)的亞微米分辨率紅外拉曼同步測量系統(tǒng)mIRage，使用寬可調(diào)諧的脈沖紅外激光源激發(fā)樣品，在樣品中產(chǎn)生調(diào)制光熱效應。通過光熱效應提取并計算紅外吸收, 通過檢測反射探頭光束強度的變化作為紅外波數(shù)調(diào)諧的函數(shù)，從而提供紅外吸收光譜。這種短波長脈沖探測光束(通常是532 nm)決定了紅外測試空間分辨率，而不是傳統(tǒng)FTIR/QCL顯微鏡中依賴的紅外波長。由于其獨特的系統(tǒng)架構(gòu)，短波長探測光束同樣也能作為一個拉曼激光源，當集成拉曼光譜儀，mIRage系統(tǒng)可以提供同一地點，同一時間，同一空間分辨率的亞微米紅外+拉曼顯微鏡的檢測結(jié)果。
 

mIRage光譜的顯著優(yōu)勢：

1. 和拉曼光譜一致的亞微米空間分辨率，比傳統(tǒng)FTIR/QCL顯微鏡提高30倍，達到500 nm；

2. 非接觸式測量，非破壞性，反射(遠場)模式測量，無須復雜的樣品制備；

3. 高質(zhì)量光譜(測試可兼容粒子形狀/尺寸和表面粗糙度)，沒有色散/散射偽影問題；

4. 可直接在商業(yè)數(shù)據(jù)庫中匹配搜索

5. 可實現(xiàn)紅外和拉曼光譜成像同步測量
 

單細胞光譜與成像——拉曼光譜技術(shù) vs.光學光熱紅外技術(shù)
 

如上文所述，拉曼散射的橫截面在指紋區(qū)相對于紅外弱五到十倍，即相比于拉曼散射,紅外吸收在指紋區(qū)域比在高波數(shù)C─H和O─H拉伸區(qū)有更大的橫截面。以PMMA為例，C-H振動模式在3.39 μm的線性吸收系數(shù)為1396 cm⁻¹，而在指紋區(qū)域，C=O拉伸振動模式在5.78 μm的線性吸收系數(shù)可達到7904 cm⁻¹，約高6倍。PMMA的紅外光譜和拉曼光譜的直接對比如下所示。指紋區(qū)域較大的紅外吸收截面可以允許mIRage顯微鏡對單一病毒進行振動光譜的檢測分析，而這對拉曼或相關(guān)拉曼光譜來說十分困難。在相同的激光功率和采集時間下，mIRage中紅外顯微鏡比拉曼光譜具有更高的信噪比，進一步可以用于檢測細菌對抗生素紅霉素等藥物的反應。綜上所述，兩種振動光譜技術(shù)并沒有相互競爭，而是提供了互補的信息，現(xiàn)在越來越多的趨勢傾向于同時獲取拉曼光譜和紅外光譜來全面研究樣品的分子振動信息。
 

參考文獻：

Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect，Sci. Adv. 2021; 7 : eabg1559.

具體案例：
 

1. 同位素標記的大腸桿菌單細菌細胞的mIRage顯微紅外譜圖與成像

近期，英國利物浦大學Roy Goodacre教授分享了關(guān)于同位素標記的細菌的振動光譜研究成果。該研究借助于單細胞亞微米分辨率紅外拉曼同步測量系統(tǒng)mIRage，通過紅外光譜和成像分析，來揭示細菌代謝的過程和機理，不僅包含細菌群落，還包含微生物之間的相互作用。由于傳統(tǒng)顯微紅外光譜儀的空間分辨率較低，目前多數(shù)研究都集中在細胞群落的評估上，而該研究作為一個重大的突破，首次使用亞微米光熱紅外光譜技術(shù)在單細胞水平上評估細菌對標記化合物的吞并行為過程。
 

參考文獻：

Imaging Isotopically Labeled Bacteria at the Single-Cell Level Using High-Resolution Optical Infrared Photothermal Spectroscopy，Anal. Chem. 2021, 93, 6，3082-3088.
 

2. mIRage顯微紅外譜與Raman光譜協(xié)同分析固定或活的單細胞

英國曼徹斯特大學的Peter Gardner教授近期發(fā)表了他們關(guān)于活(和固定)細胞振動光譜分析的新研究結(jié)果。他們使用亞微米分辨的mIRage紅外光譜及拉曼顯微鏡，并借助于兩個激發(fā)源（QCL和OPO激光器），對細胞進行了寬光譜范圍的覆蓋，從而使所有與生物學相關(guān)的分子振動都能被檢測到，且保持一致的亞微米的空間分辨率。此外，紅外光譜采集與拉曼光譜有效的結(jié)合起來，在相同的激發(fā)位置，形成振動互補，得到一套完整的振動光譜信息。如下圖所示，該紅外和拉曼的組合方式可以用來分析液體環(huán)境中固定或活細胞的亞細胞結(jié)構(gòu)，其中的蛋白質(zhì)二次結(jié)構(gòu)及富脂體均可以在亞微米尺度上被有效地識別出來。
 

參考文獻：

Analysis of Fixed and Live Single Cells Using Optical Photothermal Infrared with Concomitant Raman Spectroscopy，Anal. Chem. 2021, 93, 8, 3938–3950.
 

3. 亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)mIRage用于微塑料鑒定等相關(guān)領域
 

美國特拉華大學Isao Noda教授課題組與Photothermal Spectroscopy Corp公司合作，利用基于光學光熱紅外技術(shù)的新一代非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)mIRage對聚乳酸(PLA)和聚羥基烷酸酯(PHA)的復合薄片進行紅外拉曼同步成像分析，探究這兩種材料結(jié)合的方式和內(nèi)在機理。為探求界面處PHA/PLA組分的空間分布規(guī)律，同步和異步二維相關(guān)光譜(2D-COS，two-dimensional correlation spectroscopy)被用來分析羰基拉伸區(qū)域采集到的紅外譜圖。結(jié)果顯示，在主要為PHA的混合界面區(qū)域同時觀測到來源于PLA的1760 cm^-1紅峰外，表明部分PLA滲透到PHA層，且與PHA層的其余部分相比，界面附近的PHA結(jié)晶度明顯降低。另外，作者還通過mIRage對該區(qū)域進行了同步紅外和拉曼分析，兩者選擇性和靈敏度不同卻可以很好的互補，進一步驗證了這一發(fā)現(xiàn)的可靠性。結(jié)果證實，即使是表面上不混相的PHA和PLA聚合物對，也存在一定程度的分子混合，這種混合可能發(fā)生在界面只有幾百納米的空間水平上，很好的解釋了這兩種生物塑料之間的高度相容性。
 

參考文獻：

Two-dimensional correlation analysis of highly spatially resolved simultaneous IR and Raman spectral imaging of bioplastics composite using optical photothermal Infrared and Raman spectroscopy，Journal of Molecular Structure， DOI: 10.1016/j.molstruc.2020.128045.
 

總結(jié)

亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)mIRage作為一種新型的紅外光譜技術(shù)，具有傳統(tǒng)FTIR顯微鏡不可比擬的優(yōu)點，并克服了許多限制。首先，mIRage可以提供空間分辨率約為500 nm的紅外譜圖，遠遠超過了典型的紅外衍射極限空間分辨率，且不依賴于入射紅外波長。更重要的是，它能夠以反射/非接觸(遠場)工作模式簡單快速的生成高質(zhì)量的類似于FTIR的譜圖，從而避免了制備樣本薄切片的必要，且光譜與商用FTIR數(shù)據(jù)庫搜索完全兼容和可譯。另外，即使樣品中包含易產(chǎn)生熒光干擾的組分（壓制拉曼信號或造成其飽和），mIRage的可調(diào)制信號收集特性也確保它完全不受任何熒光的影響。IR和Raman在mIRage方法的結(jié)合下，可以充分利用這兩種互補性技術(shù)的優(yōu)勢，實現(xiàn)同步的紅外吸收和拉曼散射測量，并相互印證。

相關(guān)產(chǎn)品：
非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)