multiplex PCR預(yù)混液與六通道微滴數(shù)字PCR組合在同步準(zhǔn)確定量的應(yīng)用

法國(guó)Stilla Technologies公司開(kāi)發(fā)的—款多重PCR專用預(yù)混液：naica^®multiplex PCR MIX（見(jiàn)表1），專用于naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的多重檢測(cè)。并對(duì)naica^®multiplex PCR MIX的多重檢測(cè)性能進(jìn)行了詳細(xì)評(píng)估。當(dāng)面對(duì)有限的樣本量時(shí)，可保證多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性；在復(fù)雜背景基因存在的情況下，依然能精確檢出低豐度的目的基因。
 

★ naica^®multiplex PCR MIX在naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR上進(jìn)行6個(gè)靶標(biāo)的同步準(zhǔn)確定量

采用0.2~13000cp/ul的DNA樣品，使用10X naica^®multiplex PCR MIX在naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上進(jìn)行6個(gè)靶標(biāo)的線性范圍分析，結(jié)果顯示6個(gè)靶標(biāo)的R²均＞0.99，說(shuō)明在naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上，能夠可靠地實(shí)現(xiàn)6靶標(biāo)同步準(zhǔn)確定量（圖1)。與2X和5X濃度的數(shù)字PCR預(yù)混液(dPCR Mixes)相比，10X濃度的數(shù)字PCR預(yù)混液體積加入量降低了50％至80％，最大限度地提高樣品加入量。尤其是在檢測(cè)低濃度樣品或稀有靶標(biāo)時(shí)，樣品加入量的增加可提高檢測(cè)靈敏度。
 

▲ 圖1：使用naica^®multiplex PCR MIX在naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR上進(jìn)行6個(gè)靶標(biāo)的線性分析，分別在藍(lán)色、青色、綠色、黃色、紅色和紅外線6個(gè)通道進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)稀釋點(diǎn)的DNA濃度分別為：0.2、1.5、8.0、50、320、2050和13000 cp/ul，每個(gè)稀釋度進(jìn)行3次重復(fù)。結(jié)果顯示6個(gè)靶標(biāo)的R²均大于0.99，說(shuō)明所有靶標(biāo)的結(jié)果都高度真實(shí)可靠。
 

★ 在復(fù)雜的背景基因下，對(duì)低豐度目的基因進(jìn)行精確定量

數(shù)字PCR的—個(gè)重要技術(shù)優(yōu)勢(shì)是能夠在存在多個(gè)靶標(biāo)擴(kuò)增的情況下檢測(cè)到低濃度靶標(biāo)。為了評(píng)估naica^®multiplex PCR MIX的穩(wěn)定性。使用同一個(gè)目標(biāo)DNA模板的不同濃度系列稀釋液（0.2~ 13000 cp/uL)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)其中摻入5種外部靶標(biāo)模板（每個(gè)靶標(biāo)的濃度為3000 cp/ul)。在不同測(cè)試條件下，結(jié)果均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖2A和2C)。這些結(jié)果與同一DNA 靶點(diǎn)在不同濃度下單獨(dú)檢測(cè)以及在不添加外部靶標(biāo)的情況下獲得的結(jié)果具有可比性（圖2B和2D）。

▲ 圖2：使用naica^®multiplex PCR MIX的擴(kuò)增結(jié)果真實(shí)可靠。將pUC18質(zhì)粒（圖A和B)和pUC57質(zhì)粒（圖C和D)的13000至0.2 cp/ul的系列稀釋液在5個(gè)外部擴(kuò)增靶標(biāo)背景下（每個(gè)靶標(biāo)為3000 cp/ul(A,C)）和在不含外部靶標(biāo)(B,D)的情況下進(jìn)行定量檢測(cè)，3次重復(fù)。線性擬合系數(shù) R²>0.99，表明在不考慮多重背景的情況下，對(duì)所有靶標(biāo)的測(cè)定結(jié)果都是真實(shí)可靠的。5個(gè)外部靶標(biāo)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差保持在2.3％至3.1% (n=21)，顯示出極好的重復(fù)性。
 

★ naica^®multiplex PCR MIX應(yīng)用亮點(diǎn)

☑  實(shí)現(xiàn)數(shù)字PCR方法多重檢測(cè)的高度穩(wěn)定性和高檢測(cè)靈敏度；

☑  可在naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)同時(shí)定量檢測(cè)6個(gè)獨(dú)立的DNA靶標(biāo)，均具有良好線性關(guān)系；

☑  5X和10X的數(shù)字PCR預(yù)混液，提高了naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)高階多重檢測(cè)能力；

☑  10X PCR MIX比5X PCR MIX降低50％的體積用量，從而增加DNA的加入量。在檢測(cè)低濃度樣品或稀有靶標(biāo)時(shí)，樣本加入量的增加可提高檢測(cè)靈敏度。
 

表1 naica^®multiplex PCR MIX貨號(hào)及規(guī)格

naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國(guó)Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測(cè)，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)濃度。