三維生物打印技術(shù)在離體自然殺傷細(xì)胞檢測中的應(yīng)用（宮頸癌腫瘤模型）

 
摘要
自然殺傷(NK)細(xì)胞是一種先天免疫細(xì)胞，通過發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，在清除轉(zhuǎn)化或癌變細(xì)胞方面發(fā)揮著重要作用。近年來，一些免疫刺激分子和生物制劑被用來提高NK細(xì)胞的溶瘤作用。三維(3D)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到更好地概括體內(nèi)結(jié)構(gòu)和生理相關(guān)性，以評價這些藥物和生物制劑的體外。在這個概念驗(yàn)證研究中，我們開發(fā)了一個三維生物打印的子宮頸癌腫瘤模型，以證明NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。用Ⅰ型膠原3D生物打印GFP標(biāo)記的人宮頸癌細(xì)胞SiHa和CaSki，并與人外周血源性NK細(xì)胞共培養(yǎng)96h。NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用通過熒光顯像進(jìn)行評估，顯示在NK細(xì)胞濃度增加的情況下，腫瘤殺傷程度更高。本文描述的方法是可縮放的，與高含量成像兼容，并且容易翻譯到其他腫瘤模型。

介紹
自然殺傷(NK)細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)中的一種細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞，利用一系列預(yù)先確定的種系編碼受體來感知病原體和轉(zhuǎn)化細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞。與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞不同，NK細(xì)胞不需要腫瘤抗原特異性激活，而是在腫瘤細(xì)胞表面尋找“缺失的自我”受體，如MHC I類分子。NK細(xì)胞的溶細(xì)胞活性是由細(xì)胞表面受體傳遞激活或抑制信號的相對平衡調(diào)節(jié)的。在正常生理條件下，健康細(xì)胞表面的MHC I類分子與NK細(xì)胞上的抑制受體相互作用，而與此同時，與NK細(xì)胞上的激活受體相互作用的激活配體較少（圖1）。然而，抑制信   號超過激活信號，導(dǎo)致自我耐受(Long，2013)。腫瘤細(xì)胞傾向于下調(diào)MHC I類分子以逃避T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷，從而變得容易發(fā)生NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(Garrido，2016)。自然殺傷細(xì)胞的傳統(tǒng)特征是存在CD56細(xì)胞表面標(biāo)記物，而缺乏CD3。此外，CD16對NK細(xì)胞的功能也很重要，因?yàn)镃D16能誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)和細(xì)胞毒效應(yīng)物的活性。

NK細(xì)胞向?qū)嶓w瘤的浸潤在許多癌癥適應(yīng)癥中與更好的預(yù)后相關(guān)，包括非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌和宮頸癌(Burke，2010)。這些腫瘤組織的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的組成被認(rèn)為在NK細(xì)胞的細(xì)胞毒和浸潤功能中起著至關(guān)重要的作用，這些功能在體外模型研究中往往具有挑戰(zhàn)性。

研究了幾種三維腫瘤模型， 包括球體、懸吊液滴和微流控芯片模型，用于NK細(xì)胞毒性試驗(yàn)。例如， Giannattasio(2015)報道了一個子宮頸癌的球體模型來研究離體NK細(xì)胞殺傷效率。他（2014）使用旋轉(zhuǎn)細(xì)胞   培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)生大量均勻的球體用于NK細(xì)胞殺傷試驗(yàn)。雖然這些模型模擬了體內(nèi)環(huán)境的某些方面和一定程度的穿透，但它們中的許多沒有考慮ECM在腫瘤生物學(xué)中的關(guān)鍵作用。

3D生物打印是一項新興技術(shù)，它使研究人員能夠自動化地制造腫瘤結(jié)構(gòu)，以篩選抗癌藥物或免疫刺激劑。該技術(shù)分配一種細(xì)胞負(fù)載的ECM材料，或生物墨水，與腫瘤細(xì)胞混合，隨后化學(xué)或熱固化，以提供印刷結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度。

在此，我們探索三維生物打印技術(shù)在NK細(xì)胞毒性分析中的潛力，以幫助評價離體NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。用Ⅰ 型膠原3D生物印跡GFP標(biāo)記的人宮頸癌細(xì)胞SiHa和CaSki，并與人外周血源性NK細(xì)胞共培養(yǎng)。NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)用熒光成像進(jìn)行評估，顯示在NK細(xì)胞濃度增加的情況下，腫瘤殺傷程度更高。這里描述的方法是可擴(kuò)展的，與高含量成像兼容，并容易翻譯到其他腫瘤模型。

材料和方法
細(xì)胞及細(xì)胞系制備
人宮頸癌細(xì)胞株SiHa(ATCC HTB-35) 和CaSki(ATCC CRL-1550) 來源于ATCC。SiHa和CaSki細(xì)胞分別在EMEM和RPMI-1640培養(yǎng)基中，添加10%熱滅活FBS和1%PEN/STREP溶液。SiHa和CaSki細(xì)胞是用GFP編碼的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的(Kercher，2020)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時，用FACSaria（BD Biosciences）細(xì)胞分選器對穩(wěn)定的GFP 表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行分選。取健康供者外周血原代人NK細(xì)胞(2W-501，Lonza)，陰性選擇，冷凍保存。將NK細(xì)胞解凍后在LGM-3淋巴細(xì)胞生長培養(yǎng)基(Lonza，CC-3211)中培養(yǎng)，并加入500U/ml人重組IL-2(PeproTech,200- 02）。所有細(xì)胞均在含5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中保持在37℃。
 

圖1.三維生物打印NK細(xì)胞毒性試驗(yàn)。(A)NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性機(jī)制：NK細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞表面尋找“缺失的自身”受體，如MHC一類分子。NK細(xì)胞的溶細(xì)胞活性是由細(xì)胞表面受體傳遞激活或抑制信號的相 對平衡調(diào)節(jié)的。(B)宮頸腫瘤的3D生物打印。利用BIO X的液滴打印功能對SiHa和CaSki細(xì)胞進(jìn)行生物打印，將膠原液滴（腫瘤模型）熱凝并在培養(yǎng)液中維持4d后與NK細(xì)胞共培養(yǎng)。

生物墨水的制備與生物打印
膠原I（Coll-1,CELLINK）被中和，并按照制造商的說明與每毫升膠原1×106 SiHa或CaSki細(xì)胞混合。所有部件，包括注射器、針頭和針尖都放在冰上，直到準(zhǔn)備使用。溫度控制打印頭(TCPH)被設(shè)置為8°C，被打印的   被設(shè)置為10°C。在96孔板(n=3)中使用BIO X（軟件版本1.8）上的液滴功能分配~8μL細(xì)胞-膠原懸浮液（見圖1b)進(jìn)行三維(3D)SiHa或CaSki腫瘤的生物打�。ㄒ妶D1b)。1毫升細(xì)胞-膠原懸浮液的總體積足以在96孔板中打印腫瘤液滴。印刷后，將96孔板轉(zhuǎn)移到37°C加濕培養(yǎng)箱中20分鐘，以允許膠原聚合。接下來，在每個井中添加200μL的EMEM（SiHa）或RPMI-1640（CaSki）介質(zhì)。媒體每2天刷新一次。在第5天與NK細(xì)胞共培養(yǎng)前，培養(yǎng)4天。第4天，一些樣品用Alexa面粉647結(jié)合的鬼筆苷染色肌動蛋白。

3D共培養(yǎng)試驗(yàn)
第5天，沖洗打印出來的腫瘤，在200μL的LGM-3生長培養(yǎng)基中，在IL-2存在下，以不同效應(yīng)靶比（E：T）
（0-20）與NK細(xì)胞共培養(yǎng)72小時。陽性對照組分別與足葉乙甙或TNFα孵育，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。陰性對照組未接受任何NK細(xì)胞或凋亡誘導(dǎo)劑。

成像與統(tǒng)計
在試驗(yàn)結(jié)束時，打印出來的腫瘤在顯像前用碘化丙啶(PI)染色10分鐘。PI用DPBS洗滌兩次，去除松散粘附/ 死亡的NK細(xì)胞。GFP熒光的丟失和PI信號的升高被用作先前描述的腫瘤細(xì)胞死亡的讀出(Kercher，2020)。成像是用連接到單色相機(jī)的表熒光顯微鏡進(jìn)行的。用美國國立衛(wèi)生研究院ImageJ軟件測量熒光強(qiáng)度，用GraphPad棱鏡8翻譯并制作圖形。結(jié)果用學(xué)生t檢驗(yàn)在棱鏡上進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)測量，數(shù)據(jù)用均值±SEM表示。
   
圖2.用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)人宮頸癌SiHa和CaSki細(xì)胞表達(dá)GFP。（A-D）SiHa和CaSki細(xì)胞在二維單層上生長， 用亮場(BF)和GFP通道成像。（E-F）GFP表達(dá)細(xì)胞與I型膠原和3D型膠原混合，在96孔板中進(jìn)行生物打印。3D結(jié)構(gòu)的圖像在第4天被捕獲。（G-H）第4天，腫瘤標(biāo)本用Alexa面粉647-結(jié)合鬼筆苷染色。刻度條=100μm。

結(jié)果和討論
腫瘤細(xì)胞生長與生物標(biāo)記腫瘤形成
BIO X上的液滴功能能夠自動在96孔板中分配一致的膠原-腫瘤液滴。液滴形狀的均勻性和良好的放置有助于整個顯微鏡和分析工作流程。3d生物打印的腫瘤液滴進(jìn)行GFP熒光成像，并用PI染色測定   細(xì)胞活力。圖2所示的結(jié)果表明，在第4天，宮頸癌細(xì)胞在打印的腫瘤中是可行的。Phalloidin染色
（圖2G-H)顯示三維生物打印腫瘤內(nèi)細(xì)胞周圍有特征性肌動蛋白積累。
   
圖 3. 3D 中的NK 細(xì)胞細(xì)胞毒性測定。 (A) CaSki 細(xì)胞經(jīng)過 3D 生物打印并與NK 細(xì)胞共培養(yǎng)。 明場圖像顯示打印腫瘤周圍浸潤的 NK 細(xì)胞。 (B) 在共培養(yǎng)結(jié)束時，生物打印的腫瘤被 PI 染色，用 GFP 和 PI 通道捕獲圖像并使用ImageJ 合并。(C) 一系列E:T 比率(0 到 20) 用于共培養(yǎng)。 SiHa（頂部）和CaSki（底部） 細(xì)胞的生物打印腫瘤模型均顯示出腫瘤細(xì)胞活力的NK 細(xì)胞劑量依賴性降低。 比例尺= 100 µm。
 
腫瘤與NK共培養(yǎng)及細(xì)胞毒性分析
對NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性進(jìn)行了定性和定量驗(yàn)證。共培養(yǎng)的亮場圖像顯示了SiHa和CaSki細(xì)胞類型的腫瘤與NK細(xì)胞的相互作用（圖3A)。在熒光成像和定量后，觀察到NK細(xì)胞濃度依賴性的腫瘤細(xì)胞   存活率下降。在20:1(E:T)比下，觀察到與no NK對照組相比，腫瘤存活率降低(~60%-70%)有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0003)。圖3顯示了有無NK細(xì)胞的印刷腫瘤SiHa和CaSki的代表性圖像，當(dāng)NK細(xì)胞存在于共培養(yǎng)中時，GFP熒光質(zhì)量下降。最有趣的是，在NK細(xì)胞存在的情況下，打印腫瘤的外周顯示GFP熒光的最大減少（圖4)，表明NK細(xì)胞浸潤到打印腫瘤的膠原基質(zhì)中。然而，對NK細(xì)胞進(jìn)行特異性染   色是確認(rèn)NK細(xì)胞浸潤程度所必需的。
   
圖4. 腫瘤細(xì)胞殺傷模式。 在沒有NK 細(xì)胞的情況下，SiHa 腫瘤表達(dá)明亮的 GFP 熒光。 然而，當(dāng)與NK 細(xì)胞共培養(yǎng)時，整體 GFP 熒光強(qiáng)度降低，這在打印腫瘤的外同心環(huán)（白色箭頭指示的白色虛線）（右圖）中是顯著的。比例尺 = 500 µm。

結(jié)論和今后的方向
Ø 液滴三維生物打印技術(shù)可以作為一種自動化的過程，以人宮頸癌細(xì)胞SiHa和CaSki為代表的多功能體內(nèi)模型，以促進(jìn)免疫腫瘤學(xué)研究。
Ø 在與人NK細(xì)胞共培養(yǎng)的過程中，3D生物打印的腫瘤細(xì)胞在膠原基質(zhì)中保持受限和存活。
Ø 在細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，人外周血來源的NK細(xì)胞顯示出細(xì)胞濃度（E：T比值）依賴性的癌細(xì)胞殺傷增加。
Ø NK細(xì)胞細(xì)胞毒性試驗(yàn)與高含量成像工作流程兼容，也可適用于其他腫瘤模型，包括PDX有機(jī)化合物，以加速藥物篩選過程，并推動個性化藥物的臨床翻譯。
Ø 此外，BIO X上的多壁生物打印格式可用于擴(kuò)大對生物制劑（如免疫檢查點(diǎn)抑制劑）和工程N(yùn)K細(xì)胞（CAR-NK）的高通量篩選的支持。
Ø 進(jìn)一步的研究可能包括定量腫瘤中NK細(xì)胞的浸潤和腫瘤或T細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子。
 
參考文獻(xiàn)

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