用于研究HUVEC的iPSC多能性和毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)形成的高級(jí)體外3D模型

摘要
將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和人真皮成纖維細(xì)胞（HDFs）共培養(yǎng)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）單培養(yǎng)   分別包埋于選定的生物材料中7d。利用免疫熒光成像將這些三維培養(yǎng)系統(tǒng)的細(xì)胞標(biāo)記與二維培養(yǎng)進(jìn)行了比較，并證明了使用細(xì)胞相關(guān)材料的重要性。HUVEC與HDF共培養(yǎng)的時(shí)間是獲得復(fù)雜結(jié)構(gòu)的重要因素。在3D      中延長培養(yǎng)時(shí)間導(dǎo)致觀察到促血管生成結(jié)構(gòu)，這一現(xiàn)象只在3D中觀察到。與2D相比，iPSCs在3D培養(yǎng)時(shí)形成團(tuán)簇，細(xì)胞組裝重塑，形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，并表達(dá)多能性標(biāo)記OCT4和NANOG。iPSCs可以在3D培養(yǎng)中保持其   多能性，這使得科學(xué)家可以設(shè)計(jì)更先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)，在這種實(shí)驗(yàn)中，干細(xì)胞可以在3D嵌入后進(jìn)行分化。

介紹
由于整個(gè) 3D 矩陣中細(xì)胞自組裝和重組的差異，3D 生物打印和共培養(yǎng)類器官最近受到了廣泛關(guān)注。 單一培養(yǎng)類器官傾向于在 3D 中聚集以最大化粘附并最小化能量，而共培養(yǎng)則根據(jù)細(xì)胞間粘附的差異進(jìn)行重組
（Foty，2005 年；Napolitano，2007 年）。 一般來說，不同的細(xì)胞類型在細(xì)胞重組過程中也會(huì)相互顯著影響。 例如，單獨(dú)的內(nèi)皮祖細(xì)胞不會(huì)形成血管組織，但當(dāng)與人真皮成纖維細(xì)胞(HDF) 或平滑肌細(xì)胞類型共培養(yǎng)時(shí)，血管內(nèi)皮管可以在多孔生物材料或生物墨水中形成 (Unger, 2007)。 一項(xiàng)使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC) 的研究表明，這些細(xì)胞在沒有成纖維細(xì)胞的情況下無法形成內(nèi)皮細(xì)胞腔，這凸顯了共培養(yǎng)系統(tǒng)的重要性（Newman，2011）。
 
在研究過程中，對(duì)HUVEC培養(yǎng)的相關(guān)標(biāo)記進(jìn)行了分析。分化簇31(CD31)是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物，用于二維和三維培養(yǎng)中監(jiān)測內(nèi)皮細(xì)胞的分化、自組裝和血管生成。CD31在HUVECs表面表達(dá)，并已知在類有機(jī)分子內(nèi)自組織(Wu，2004)。occludens-1(ZO-1)是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白，作為支架分子，是上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞   緊密連接的組成部分。ZO-1氨基末端能與claudins和α-catenin/cadherins結(jié)合，羧基末端能與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相互作用(Itoh，1997)。表明在上皮細(xì)胞中，ZO-1是三維形成管腔所必需的。在排列的HUVEC三維培養(yǎng)中，ZO-1在緊密連接的功能性內(nèi)皮形成中發(fā)揮重要作用(Kang，2018)。
 
多能性標(biāo)記OCT4、SOX2和NANOG在維持胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（iPSCs）的穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用。證據(jù)表明，在分化和發(fā)育過程中，它們表達(dá)模式的改變控制著細(xì)胞的命運(yùn)(Wang，2012)。例如，OCT4 調(diào)節(jié)BMP4通路并與之相互作用，以指定不同的發(fā)育命運(yùn)。高水平的OCT4能在缺乏BMP4的情況下自我更新，但在存在BMP4的情況下指定中胚層。低水平的OCT4在沒有BMP4的情況下誘導(dǎo)胚胎外胚層分化，但在   有BMP4的情況下明確胚胎外譜系。SOX2抑制中胚層分化， 而NANOG抑制胚胎外胚層分化(Rizzino， 2016)。這表明了在3D基質(zhì)中嵌入iPSCs或在2D中培養(yǎng)時(shí)保持這些多能性標(biāo)記的重要性。
 
材料和方法
細(xì)胞制備
將HUVECs培養(yǎng)在大血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，添加生長補(bǔ)品(Cellworks，ZHM-2953)，并添加0.1%慶大霉素/ 兩性霉素抗生素(Gibco，R-015-10)。新生兒HDF在成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基（促進(jìn)細(xì)胞，C-23010)中培養(yǎng)。iPSCs按Celllatis's培養(yǎng)方案培養(yǎng)。iPSCs在Synthemax II-SC基質(zhì)（Corning,3535）涂層上培養(yǎng)，并用Versene溶液（Gibco,15040-033）分離。培養(yǎng)基為Cellartis DEF-CS 500無Xeno培養(yǎng)基（Takara Bio，Y30045)，添加添加劑（Takara Bio，Y30042)和1%慶大霉素/兩性霉素(Gibco，R-015-10)。

生物墨水的制備與生物打印
對(duì)于HUVEC-HDF生物打印，將GFP標(biāo)記的HUVEC細(xì)胞以1：1的比例與HDFs混合，并與bioink、Matrigel Matrix(Corning，354234)或GelMA(CELLINK，IK305102)混合，以200萬細(xì)胞/ml的比例添加纖維連接蛋白， bioink與細(xì)胞的比例為9：1。bioink和細(xì)胞在兩個(gè)注射器之間混合，然后通過連接的22g噴嘴(CELLINK， NZ4220005001)分配。Gelma基樣品在3 cm處光交聯(lián)15秒，Matrigel基樣品在37℃下熱交聯(lián)20分鐘后加入介質(zhì)。在每周更換3次的HUVECs培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
對(duì)于iPSCs生物打印，細(xì)胞以100萬個(gè)細(xì)胞/ml的比例在兩個(gè)注射器之間以10：1的比例bioink（Matrigel或
GelMA ， 補(bǔ) 充 層 粘 連 蛋 白 521(GelMA+LN521)) 與 細(xì) 胞 （ V/V ） 混 合 ， 并 通 過 20g 噴 嘴
（CELLINK,NZ4200005001)分配。GelMA光交聯(lián)5～10秒，Matrigel熱交聯(lián)。培養(yǎng)基每天更換。
一般情況下，所有樣品在未經(jīng)處理的96孔板(VWR，7342781)中以液滴形式生物打印，使用
BIO X（CELLINK,D16110020717)和在100微升相應(yīng)生長培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)所有的光交聯(lián)都是在405nm的光模塊上進(jìn)行的。2D細(xì)胞在腔室細(xì)胞上培養(yǎng)
培養(yǎng)幻燈片(Falcon，354108)。所有培養(yǎng)物均保持在37°C和5%CO2下。分別于3d和2d培養(yǎng)5～14d和3～4d， 用免疫組織化學(xué)(IHC)分析不同標(biāo)記物的表達(dá)。

免疫染色
用4%多聚甲醛（CaCl2 50 mM）固定5～6小時(shí)，然后用乙醇和二甲苯脫水。在用切片機(jī)切片至5μm厚之前，用石蠟浸潤和包埋這些結(jié)構(gòu)。切片在顯微鏡載玻片上固定，并在二甲苯和乙醇中分離。用抗原回收緩   沖液煮沸制備抗體染色樣品，然后用封閉液處理。2D細(xì)胞固定1～3h，用0.5%Triton-X100滲透，用封閉液   處理。將一抗溶液加入所有玻片中，在4℃下孵育過夜。切片經(jīng)PBS洗滌后，在室溫下用二次抗體處理1h。細(xì)胞核用NucBlue固定細(xì)胞ReadyProbes試劑(Invitrogen，R37606)反染。將蓋片安裝在載玻片上，并附上氟蒙特-G(Invitrogen，00-4958-02)。用熒光共聚焦顯微鏡（ZEISS LSM710 NLO）在相同的采集參數(shù)下分析次級(jí)抗體的定位。

結(jié)果和討論
HUVEC-HDF共培養(yǎng)：為了確定不同基質(zhì)對(duì)HUVECs和HDF共培養(yǎng)的影響，首先用熒光顯微鏡觀察其形態(tài)差異。生長在Matrigel和GelMA纖維連接蛋白中的細(xì)胞形成致密的網(wǎng)絡(luò)，表現(xiàn)為細(xì)長的表型，而2D細(xì)胞表現(xiàn)為   細(xì)長較少而圓形較多的形態(tài)（圖1）。此外，二維圖像顯示GFP-HUVECs在少數(shù)上皮細(xì)胞中呈簇狀分布。
  圖1.GFP 標(biāo)記的 HUVEC（綠色）在 2D 單層（第 3 天）和Matrigel（第 7 天）和 GelMA 纖連蛋白（第 14 天）上的 3D 培養(yǎng)中與 HDF 共培養(yǎng)。 比例尺= 100 µm。
 
ZO-1染色：除了細(xì)胞形態(tài)外，緊密連接在內(nèi)皮屏障功能的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。為此，對(duì)緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1進(jìn)行免疫染色，分析其在2D和不同3D基質(zhì)中的細(xì)胞分布。如圖2所示， 在第15 天，在GelMA纖維連接蛋白Sam-ples 中檢測到高水平的ZO-1。在GelMA 纖維-果膠樣品中也觀察到幾個(gè)芽， 表明這些細(xì)胞具有形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力。有趣的是，ZO-1二維染色不僅局限于HUVECs ， 也可在HDFs中檢測到， 提示一個(gè)含有合適ECM成分的三維環(huán)境對(duì)維持不同細(xì)胞系蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和時(shí)空表達(dá)是必要的。
  圖2.GFP-HUVEC和HDF共培養(yǎng)2d（第3天）和Matrigel
（第8天）和GelMA纖維連接蛋白（第15天）分別用ZO- 1（紅色）和DAPI（藍(lán)色）染色。比例尺=100μm。
 
CD31染色：為進(jìn)一步鑒定共培養(yǎng)物，對(duì)特異性內(nèi)皮標(biāo)記物CD31進(jìn)行免疫熒光染色。毫不奇怪，CD31的表達(dá)僅限于2D 和 GelMA 纖 維 連 接 蛋 白 第 15 天 的HUVECs，這可以通過重疊表達(dá)GFP和CD31/DAPI 的HUVECs 圖像面板顯示（圖3）。不幸的是，在atrigel第8天培養(yǎng)中檢測到非常低水平的CD31，這可以由GFP信號(hào)所示的視野中HUVECs細(xì)胞的非常低數(shù)量或缺乏來解釋（圖3）。
  圖3.GFP-HUVEC與HDF共培養(yǎng)2d(3d)、3d、3d，CD31（紅）、DAPI（藍(lán)）染色，Matrigel(8d)、GelMA纖維連 接蛋白(15d)染色。比例尺=100μm。
   
圖4.在3DMatrigel或Gelma+LN521中對(duì)培養(yǎng)4d后的iPSCs進(jìn)行2d和7d的亮場圖像。比例尺=100μm。
 
接下來，用亮場顯微鏡觀察生長在2D和3D簇中的iPSC細(xì)胞的形態(tài)，如圖4所示。在Matrigel和Gelma+LN521 中均觀察到不同大小的球體。此外，還對(duì)三個(gè)多能性標(biāo)記OCT4、NANOG和SOX2的表達(dá)進(jìn)行了評(píng)估。

多能性標(biāo)記物 OCT4 在所有條件下都有不同程度的表達(dá)，如圖 5（上圖）所示。在 2D 中，在細(xì)胞簇的周邊觀察到最高的信號(hào)強(qiáng)度。而在 Matrigel 中，信號(hào)強(qiáng)度均勻分布在整個(gè)樣品上。對(duì)于圖 5（ 中圖）中的NANOG 染色樣品，觀察到非常相似的表達(dá)模式。需要更長的曝光時(shí)間來可視化圖 5（下圖）所示的 2D 樣品中的 SOX2 表達(dá)。除了多能標(biāo)記物的表達(dá)外，還觀察到 GelMA+LN521 中細(xì)胞簇的環(huán)狀形態(tài)，主要是在Matrigel 中。這些空心簇類似于神經(jīng)玫瑰花結(jié)或早期中胚層結(jié)構(gòu)（Muratore，2014）。然而，需要進(jìn)一步分析以確認(rèn)任何潛在的分化，因?yàn)閕PSC 在觀察到細(xì)胞聚集的所有條件下都保留了 OCT4 和 NANOG 的表達(dá)。這些多能性標(biāo)記物不是所有分化命運(yùn)的泛阻遏物，而是每個(gè)控制向特定譜系的分化。例如，NANOG 抑制胚胎外胚層分化而對(duì)其他譜系幾乎沒有影響，而SOX2 抑制中內(nèi)胚層分化（Wang，2012）。轉(zhuǎn)錄因子小心翼翼地相互作用以將細(xì)胞保持在多能狀態(tài)，與其他因子相比， 一種因子表達(dá)的微小變化可導(dǎo)致分化
（Rizzino，2016 年）。免疫熒光觀察到的微小變化不是定量的，但表明即使在嵌入和 3D 生物打印后仍保留了多能性標(biāo)記，為 3D 生物打印過程后的分化開辟了新的機(jī)會(huì)。
  圖 5. 2D 培養(yǎng) 4 天和 3D Matrigel 或GelMA+LN521 培養(yǎng) 7 天后 iPSC 中的OCT4、NANOG 和 SOX2 表達(dá)。 所有圖像均使用相同的采集參數(shù)捕獲，但SOX2 的 2D 圖像已為可視化進(jìn)行了增強(qiáng)。 比例尺 = 100 µm。
 
結(jié)論和今后的方向
與二維細(xì)胞培養(yǎng)相比，3D生物打印顯示出多種優(yōu)勢，包括多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的精確幾何排列，可以更好地再現(xiàn)自然的三維人體生理學(xué)。細(xì)胞根據(jù)來自周圍細(xì)胞和環(huán)境的外部信號(hào)進(jìn)行自組裝。這一重要現(xiàn)象有助于理解胚   胎發(fā)生、血管生成、傷口愈合和腫瘤形成，也可能有助于開發(fā)新的生物人工器官血管化藥物和途徑。這項(xiàng)   研究得出以下結(jié)論：
· 三維環(huán)境對(duì)于HUVECS復(fù)雜結(jié)構(gòu)的發(fā)展和網(wǎng)絡(luò)形成至關(guān)重要。
· 三維培養(yǎng)時(shí)，iPSCs形成團(tuán)簇，重塑細(xì)胞組裝，形成環(huán)面狀結(jié)構(gòu)。在2D控制中沒有觀察到類似的iPSCs重排。
· 在2D和3D中，iPSCs表達(dá)多能性標(biāo)記OCT4和NANOG,而SOX2在2D中的表達(dá)低于3D。
· iPSCs可以在3D培養(yǎng)中保持其多能性，這使得科學(xué)家可以設(shè)計(jì)更先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)，在3D嵌入后可以進(jìn)行干細(xì)胞分化。

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