CELLINK肝組織模型試劑盒A使用方法與應用實例

說明
肝組織模型試劑盒提供了用于包封肝細胞和/或星狀細胞的最佳生物墨水，然后進一步利用所提供的抗體通過免疫熒光或免疫組織化學進行功能分析。

包含：
CELLINK LAMININK 111 bioink-3 mL
Ⅰ型膠原抗體*-100µL
ABCC2抗體*-100µL
CYP3A43抗體*-100µL

*宿主：兔，已驗證物種反應性：人 1

儲存
生物墨水應該儲存在攝氏4到8度之間。生物墨水的保質期是兩個月。包裝上注明了有效期。在儲存之前，確保墨盒蓋上蓋子，以防干燥。保持生物墨水不凍-將生物墨水放入冷凍室有可能損害其印刷適性。

抗體到達后應保存在-20°C。當儲存在-20°C時，抗體的作用至少為12個月。注意，抗體是非常穩(wěn)定的，當適當儲存時，可以使用更長的時間。抗體在-20°C保存前不需要等分。由于抗體是在甘油中提供的，它們在推薦的儲存溫度下不會凍結，因此不會暴露于冷凍/解凍循環(huán)中。

與細胞混合
我們建議將生物墨水與高濃度的細胞混合。您可以手動混合細胞，也可以使用我們革命性的細胞混合器，以獲得更大的數量。CELLMIXER的設計目的是簡化混合過程，并使細胞的存活率提高，從而獲得均勻的懸浮液。有關更多詳細信息，請參閱Mixing with Cells Protocol CELLINK

生物打印組織模型
肝組織模型可以通過在所需生物墨水（CELLINK LAMININK 111）中逐層生物打印肝細胞和/或星狀細胞來生成。如果用原代細胞進行生物打印，有限的細胞數目將限制構建體的大小。因此，10-50µL的結構、液滴或圓盤足以用于藥物篩選目的。還可以生成更大的構造，特別是當需要單元格分層時。

交聯(lián)
用含CaCl2的交聯(lián)溶液進行GelXA LAMININK 111生物打印的構建體的交聯(lián)。生物打印后，應用足夠的液滴交聯(lián)溶液覆蓋構建物。30秒到5分鐘的孵育時間對于大多數結構來說是足夠的。孵育后，除去交聯(lián)液，用含鈣和鎂的Hank's平衡鹽溶液(HBSS+/+)或基礎細胞培養(yǎng)基洗滌并加入所需的細胞培養(yǎng)基。

組織學分析
要獲得生物打印結構的5-8µm切片，請參閱CELLINK網站支持部分下的固定、嵌入和切片協(xié)議CELLINK系列。然后按照免疫熒光染色程序CELLINK  Series對組織模型進行抗體染色。I型膠原、ABCC2和CYP3A43抗體的稀釋度如下：

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CELLINK LAMININK 111 Bioink的描述
CELLINK層狀油墨111除了對光不敏感之外，在任何溫度下具有穩(wěn)定的印刷適性是有利的。利用CELLINK的優(yōu)化的染色和分析協(xié)議，CELLINK LAMININIK 111生物墨水提供了一個平滑的3D生物打印過程，其中的焦點允許在獲得的結果。CELLINK bioink中的納米纖維素提供了可影響不同肝細胞類型的相互連接的原纖維網絡，例如，潛在地促進膽管網絡的形成或共培養(yǎng)組織模型中星狀細胞的排列。

抗體描述
肝組織模型的直接功能分析可以通過免疫熒光或免疫組化的組織學分析進行。肝組織模型試劑盒中包含的抗體用于肝細胞和星狀細胞在生物打印構建體中的單一或共培養(yǎng)。I型膠原抗體是用來評估在纖維化誘導過程中星狀細胞產生I型膠原的情況。ABCC2抗體用于評價肝細胞中轉運體多藥耐藥蛋白2(MRP2),CYP3A43抗體用于分析細胞色素P450中負責藥物代謝的一種酶。

肝抗體數據
用包括初級抗體I型膠原、ABCC2和CYP3A43的免疫熒光分析的內部數據證明了對不同肝細胞類型和來源的優(yōu)化使用。
 

圖1:實施例I型膠原在用共培養(yǎng)LX2和HepG2細胞增強的3D生物打印CELLINK LAMININK 111中的表達。合并圖像I型膠原表達（1:50稀釋度），綠色，細胞核用DAPI（1:50稀釋度）染色，藍色。二抗：Alexa Fluor 488。放大倍數：10倍，刻度線：100µm。
 

圖2. 用共培養(yǎng)的LX2 和HepG2 細胞增重的3D生物打印的CELLINK LAMININK 111 中ABCC2表達的實例。ABCC2(MRP2)抗體既可用于肝細胞HepG2細胞株的染色，也可用于原代肝細胞的染色。合并圖像ABCC2表達（1:20 0稀釋度）,綠色,細胞核染色DAPI（1:50 稀釋度）,藍色.二抗：Alexa Fluor 488。放大倍數：10倍，刻度線：100µm。
 

圖3.作為肝組織模型的3D生物打印的原代肝細胞中CYP3A43表達的實例。CYP3A43抗體可用于原代肝細胞的團簇和單細胞染色。合并圖像CYP3A43表達（1:10  00稀釋度）,綠色,細胞核DAPI（1:50稀釋度）染色,藍色。二抗：Alexa Fluor 488。放大倍數：10倍，刻度線： 100µm。